特異的な検出が可能なボレリア（Borrelia）抗原と抗体をラインアップ ライム病研究試薬

ライム病研究に使用できる、ボレリア（Borrelia）抗原および抗体です。
特異性が高く、感染段階に関わらずにライム病を検出することができます。

ライム病（LD）

ライム病（LD: Lyme disease）は、ボレリア（Borrelia）属のスピロヘータという細菌によって引き起こされる感染症です。アメリカでは Borrelia burgdorferi がライム病の主な原因となりますが、ヨーロッパでは Borrelia afzelii と Borrelia garinii が、発生の大部分に関与しています。CDC（米国疾病管理予防センター）は、アメリカ国内において 2008 年から年間約 30,000 件のライム病が確認されたとしていますが、実際には 300,000 件近いことを示唆しています。年間 250 万回の血清診断が行われており、その多くは繰り返しの検査です。CDCは、ライム病の診断に、2ステップ法による試験を推奨しています。第1ステップであるELISAベースのスクリーニングと、第2ステップであるウェスタンブロットにより、抗ボレリア抗体の存在を確定します。

問題点

現在行われているライム病検査は、時間がかかるだけではなく、偽陰性や偽陽性の結果が出る可能性があります。現在の方法の欠点の一つは、ウェスタンブロットに使用する細胞ライセート中の B. burgdorferi タンパク質には、多数の高度に保存されたタンパク質が含まれるため、他の細菌感染症に対する抗体で検出した際に、偽陽性となる可能性があることです。もう一つの欠点は、血中に含まれる抗 LD 抗体の種類は個人により異なるため、現在行われているELISA法やその他の試験を用いたライム病検査に反応性を持つ抗体が存在しない場合があることです。現在行われているライム病検査では、一種類もしくは選ばれた少数のライム病抗原を用いて、患者サンプル中のLD特異的抗体を検出します。しかし、B. burgdorferi は複雑な生活環を持つため、一種類のタンパク質抗原を診断マーカーとして用いることが難しく、既存のアッセイ法ではライム病の有無を適切に診断できない場合が多くあります。

B. burgdorferi は生活環に数種類の段階があり、各段階で異なるタンパク質のサブセットが発現することから、適切な診断が困難です。LD の原因となるスピロヘータは、シカダニから、ペット・家畜・ヒトなどの哺乳動物宿主へ移行します。B. burgdorferi は、生活環の各段階で、環境シグナルに応答して遺伝子発現が迅速に調節されます。このような変化の間に、細菌タンパク質のシグネチャーが調節され、持続感染が可能になります。宿主は、発現しているタンパク質や、VlsE のような強い抗原に対してのみ、抗体を産生します。このような理由から、抗 B. burgforferi タンパク質の検出は非常に困難です。

Rockland社の解決法

Rockland社では、B. burgdorferi の免疫機構を回避する性質や生活環の変化に対応することで、患者個々の反応を検出することを可能にしました。感染の3つの段階（感染初期／潜伏期／慢性期）に特異的な「research toolbox matrix」を作成し、14種類の Borrelia 特異的抗原をクローニング・発現・精製しました。これらの14種類の抗原は、携帯型のポイント・オブ・ケア（POC）検査の開発や、ヒト血清中の抗 Borrelia IgM および IgG 抗体のマルチプレックス検出への使用が期待されています。また、これらの抗原はライム病の異なる段階において発現することから、患者の感染段階に関わらずにライム病を検出することが可能になります。

• 特異性が高く、従来のライム病検査よりも優れた検出性能
• 従来の C6 VlsE ELISA 法で偽陽性となるサンプルを、正確に陰性と識別することが可能

POC（Proof-of-Concept）試験

（画像はクリックで拡大されます）

血中LD-特異的抗体を検出するストリップベースの診断検査の機能性を検証するために、14種類のリコンビナントLDタンパク質を、スロットブロッターを用いてニトロセルロース膜にインプリントした。さらに、ブロッキングの前に、二次抗体特異的コントロール（IgG および IgM）とMBPをメンブレンに吸着させた。ポジティブ／ネガティブ LD ヒト血清を用いて、リコンビナントタンパク質に結合させ、ペルオキシダーゼ（HRP）標識抗ヒト IgG F（c） または抗ヒト IgM Fc5m 二次抗体を添加した。

B. burgdorferi 遺伝子の E. coli 発現ベクターへのクローニング

感染後の in vivo における生活環の重大な変化を代表する、複数の（>14） B. burgdorferi 特異的タンパク質を用いたスクリーニング

OspA	Crasp-2
OspB	DbpA
OspC	DbpB
OspE	Arp37
Flagellin	P35
VlsE	P39
Crasp-1	P27

* 例えば、OspE およびデコリン結合タンパク質（Dbp）A/B は、哺乳類に自然に感染した場合に発現しますが、培養では発現しません。

アプリケーション

この技術は、現在行われている ELISA、ウェスタンブロット、イムノブロットなどの検査方法に対応しますが、下記の方法で使用することも可能です。

• ラテラルフロー法 ストリップテスト
  特別な装置を使用せずに標的の検体を検出できるイムノクロマトグラフィー測定法で、わずか数分で結果を得ることが可能です（従来の方法では数日または数週間）。
• マルチプレックスプラットフォーム
  1つのサンプルから、複数の検体を迅速かつハイスループットに評価することが可能で、サンプルの取り扱いや処理にかかる手間を最小限にすることができます。

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