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研究用

Cellulase を短時間で簡単に測定できますMarkerGene™ 蛍光セルラーゼアッセイキット

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セルラーゼを短時間で簡単に検出できるキットです。
マイクロタイタープレートを用いてアッセイを行います。

MarkerGene™ Fluorescent Cellulase Assay Kit

背景

セルラーゼ とは?

セルラーゼとはβ‐グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼなどが含まれる酵素ファミリーです。これらの酵素は、セルロースを構成するグルコースのβ-1,4-D-グリコシド結合を切断します。セルラーゼは植物で産生される他、植物病原体を含む多くの真菌や微生物もセルラーゼ活性を有することが報告されています。セルロース分解は、動物でも共生体により行われますが、動物細胞がセルラーゼを産生しているかはその多くで明らかとなっていません。しかし、近年の報告から、昆虫や節足動物などの数種類の動物でセルラーゼが産生されていることが示唆されています。

セルラーゼ活性の研究は、植物分子生物学、農業、工業において有用性があります。また、セルロースの加水分解により得られるグルコースはエタノール発酵が容易なため、代替燃料の開発においても注目されています。

使用目的

本キットに含まれる長波長蛍光基質 Resorufin Cellobioside(単品での品番: M1238)を用いて、セルラーゼ活性をモニターすることができます。切断の際に、蛍光化合物 Resorufin (単品での品番:M0202)が放出され、マイクロプレートを用いて活性を容易に検出することができます。本キットには、200検体とコントロール(反応量 100µL)分の試験に十分な基質が含まれています。

構成内容

  • 反応バッファー
  • 基質試薬(5mM Resorufin Cellobioside in DMSO)
  • スタンダード(5mM Resorufin in DMSO)
  • 停止溶液
  • DMSO

製品データ

Resorufin Cellobioside を用いた Arabidopsis thaliana のセルラーゼ活性の測定

図1  Resorufin Cellobioside を用いた Arabidopsis thaliana のセルラーゼ活性の測定
2つの成熟したシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana、CS-20系統)の花芽のセルラーゼ活性を測定した。

Resorufin Cellobioside を用いたセルラーゼ活性の測定

図2  Resorufin Cellobioside を用いたセルラーゼ活性の測定
Trichoderma reesei 由来の精製セルラーゼを反応バッファーで様々な濃度に希釈し、セルラーゼ活性を測定した。

FAQ

【01】 本キットは生細胞の染色に適していますか?

残念ながら、本キットの染色バッファーは pH が低く、生細胞イメージングに適しておりません。

【02】 反応バッファーのpHはいくつですか?

反応バッファーのpHは6.0です。これは多くのセルラーゼの最適pHの上限値で、一般的に最適pHは 4.0-6.0 とされています。このpHの反応バッファーを用いると、基質のターンオーバーにより、アッセイを停止させた場合よりも蛍光強度が経時的に増加し、連続的な測定が可能になります。

【03】 アッセイを行う前に、酵素を可溶化するために界面活性剤を添加できますか?

酵素を可溶化するために界面活性剤を添加する場合は、反応バッファーでさらに希釈しても酵素が溶解したままであることを確認して下さい。溶解性を維持するために界面活性剤が必要な場合は、ブランクのウェルに同じ濃度の界面活性剤を加え、アッセイに影響しないか確認して下さい。

【04】 ブランクのウェルには何を添加すれば良いですか?

ブランクのウェルには、酵素もスタンダードも不要です。50µL の反応バッファーを添加してください。

【05】 この反応の酵素反応速度はどのように計算すれば良いですか?

多くの蛍光プレートリーダーや蛍光光度計の測定結果からは、相対的な蛍光強度が得られるだけなので、これらの測定値を基質の時間あたりのターンオーバー数(µmol)に変換する必要があります。酵素のターンオーバー数(速度)の一般的な単位は µmole/min/mL です。この変換を行うには、スタンダード(レゾルフィン)を様々な濃度でプロットします(スタンダードカーブ)。次に、スタンダードカーブを用いて、プレートリーダー(または蛍光光度計)の相対的な蛍光測定値を、生成したレゾルフィン量(µmol)に変換することができます。時間に対するターンオーバー数をプロットし、次に様々な基質濃度での初速度(曲線に接する)を求め、速度を計算します。さらに、Lineweaver-Burk プロットとして、通常は横軸に 1/S、縦軸に 1/v をプロットすることで、Km、Vmax のような酵素と基質のさまざまなパラメーターを求めることができます。Lineweaver-Burk 曲線を使用して、さまざまな阻害剤を反応に加えた際の阻害定数を決定することも可能です。

【06】 本キットで得られたローデータからどのように酵素活性(U/mL)を計算すれば良いですか?

セルラーゼ活性を計算するためには、サンプルのアッセイと共に、精製酵素を用いてスタンダードカーブを作成し、濃度とRFUをプロットします。このグラフを使用して、サンプルのRFUに基づきセルラーゼ活性を推定することができます。

MarkerGene™ 蛍光セルラーゼアッセイキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
MarkerGeneTM Fluorescent Cellulase Assay Kit詳細データ MGT M1245 1 KIT
¥84,000

製品使用文献

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  2. Speda J, Johansson MA, Odnell A, Karlsson M.(2017) "Enhanced biomethane production rate and yield from lignocellulosic ensiled forage ley by in situ anaerobic digestion treatment with endogenous cellulolytic enzymes." Biotechnol Biofuels. 10:129. doi: 10.1186/s13068-017-0814-0. eCollection 2017.
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参考文献

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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