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記事ID : 16366
研究用

インタクトなミトコンドリアを30分以内で高速分離!ミトコンドリア単離キット(哺乳類細胞/組織用)

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本製品は、哺乳類細胞や組織からインタクトなミトコンドリアを30分以内に単離することができるキットです。抽出物には、界面活性剤や EDTA が含まれません。

101 Bio社 高速・簡便なタンパク質抽出キット

特長

  • 迅速 - 30分以内で抽出完了
  • 高収率・高濃度 - 1〜3 mg/mL
  • 少量のサンプルに最適 - 細胞数 5〜40×106 個に対応

構成内容

  • バッファーA
  • バッファーB
  • フィルターカートリッジ
  • キャップ付きコレクションチューブ
  • プラスチック棒
  • 組織分散ビーズ

プロトコール

  1. バッファーAバッファーBを完全に融解し、転倒混和後、氷上に置きます。また、フィルターカートリッジを取り付けたコレクションチューブとPBSも氷上で予備冷却します。
  2. 培養細胞の場合、5〜40x10個の細胞を低速で遠心します(500〜600xg、5 分間)。組織サンプルの場合、ステップ3から開始してください(ステップ3へ)。
    冷却PBSで細胞を洗浄します。上清をアスピレート後、250μLのバッファーAを加えて、ボルテックスします。氷上で5〜10分間インキュベートし、30秒間ボルテックスします。細胞懸濁液を直ちにフィルターカートリッジに移します(ステップ4へ)。
  3. 組織サンプルの場合、10〜30 mgの新鮮/凍結組織をフィルターカートリッジに入れ、250μLのバッファーAを加えます。付属のプラスチック棒を使用し、フィルター表面に組織を押し当てるようにして1分間組織を破砕します。
    キャップを開けた状態にして、氷上で5分間インキュベート後、ステップ4に進んでください。

    Note:

    • 骨格筋心筋サンプルを用いる場合、破砕前にフィルターに100〜120 mgの組織分散ビーズを追加することを推奨します。
    • ホモジナイズされずに残った少量の組織は、サンプルの品質に影響しません。
    • プラスチック棒は再利用できます。75%エタノールでふき取った後、蒸留水でリンスしてください。
  4. フィルターカートリッジに蓋をして、14,000 rpm(16,000xg)で30秒間遠心します。
  5. フィルターを捨て、10秒間のボルテックスでペレットを再懸濁します。
  6. 3,000 rpm(700xg)で1分間遠心します。上清を2.0mLチューブに移し、400μLのバッファーBを加えます。10秒間のボルテックスで混合します。
  7. 14,000 rpm(16,000xg)、4℃で10分間遠心します。上清を除去し、ペレットに200μLのバッファーBを加えます。10秒間のボルテックスで再懸濁します。
  8. 10,000 rpm(8,000xg)、4℃で5分間遠心します。上清を2.0mLチューブに移し、冷却したPBS 1.6mLを加えます。
  9. 14,000 rpm(16,000xg)〜16,000 rpm(18,000xg)、4℃で15分間遠心します。上清を捨て、ペレットを保存します(インタクトなミトコンドリアの単離完了)。
    ミトコンドリアペレットは、界面剤を含む10〜200 μLのバッファー*で溶解させることができます(*例 5% Triton X-100 in calcium-free PBS)。通常、5〜200 μgのタンパク質を得ることができます。
    ミトコンドリアのトータルプロテイン抽出には、「3分間 トータルタンパク質抽出キット(動物細胞用)[品番:P501]」をご利用いただけます。
    また、ミトコンドリアの膜タンパク質およびマトリックスタンパク質の抽出には、「細胞膜タンパク質抽出キット[品番:P503]」をご利用いただけます。

使用例

トータルタンパク質とミトコンドリアタンパク質のウェスタンブロットによるマーカー解析

トラブルシューティング

問題点解決方法
抽出タンパク質の収量が低い サンプルの初期細胞数を増やしてください。
ステップ2およびステップ3のインキュベート時間を10分に延長してください。
抽出タンパク質の活性が低い ライセートを冷却し続けてください
プロテアーゼインヒビターを添加してださい。
30秒間の遠心後、フィルターカートリッジ上に細胞溶解物が残る サンプル量を減らすか、遠心時間を2分間に延長してください。

ミトコンドリア単離キット(哺乳類細胞/組織用)

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Mitochondria Isolation Kit (Mammalian cells/ tissues)詳細データ OBL P507L 50 RXN
¥112,000

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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