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抗体に代わる特異性の高いDNAアプタマーを迅速に提供します！アプタマー探索受託サービス
NeoVentures社：抗体に代わる特異性の高いDNAアプタマーを迅速に提供します！

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メーカー名：NeoVentures Biotechnology Inc.（略号：NVB）

NeoVentures 社は、アプタマーを用いた食品検査商品の製造販売に成功している唯一の会社であり、アプタマー探索・合成のグローバルリーダーです。独自に開発したアプタマー選抜法であるDubbles selection strategy という手法を用いてご希望のターゲット分子を認識する特異性の高い DNA アプタマーの探索受託サービスを承ります。

よくあるご質問

アプタマーとは？

アプタマーとは抗体のように特定の標的分子に対して特異的に結合する合成 DNA/RNA 分子です。アプタマーは試験管内で短時間に合成することが可能であり、免疫原性もほとんどなく、金属イオンや低分子有機化合物、毒物等に特異的なアプタマーも合成可能であるという抗体にはない利点を有しています。また、DNA アプタマーは RNA アプタマーに比べ化学的に非常に安定であり、蛍光物質やビオチンをつけたアンチセンス鎖で検出が可能です。

Introduction to Aptamer

Why use Aptamers?

Dubbles selection strategy の特徴

Dubbles selection strategy は核酸アプタマーを得る手法としてよく知られている SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 法に比べ下記のような優位性があります。

特異性の高いアプタマーを選別可能
PCRアーティファクトが減少
選択スピードが早い
同時に複数ターゲットの選択も可能
本手法で作製したアフラトキシンアプタマーの解離定数 Kd＝約 10 nM ^*

＊一般的な抗体の Kd 値は、数百マイクロモル（10^-6）から数百ナノモル（10^-7 ～ 10^-9）程度で、Kd 値が数百ナノモル（10^-9）よりも小さい抗体は、非常に親和性が高い（反応が強い）抗体です。

Dubbles selection strategy	SELEX 法
一本鎖 DNA のプール（10¹⁵）を作製する（ランダムサイトの長さは 40 ヌクレオチド）。標的分子を固定化したアフィニティカラムにアプライする。バッファーで洗浄して弱い結合の DNA を洗い流す。また、標的分子と類似構造を有する分子をアプライするカウンターセレクションを行い、特異性の低い DNA を除く。過剰量の標的分子で DNA を溶出することで、固定化した分子だけでなくフリーな分子にも結合する DNA を分離する。 PCR により DNA を増幅する。増幅した二本鎖 DNA を熱変性させた後に再度アニールさせることで得られる DNA は両端の相補的な部位のみで二本鎖を形成し、ランダム領域は一本鎖の状態が保たれる。この二本鎖オリゴを「Dubbles」と呼び、二本鎖のまま再度カラムにアプライすることが可能。SELEX 法のネックである一本鎖 DNA の調製過程を省くことができる。 2. ～ 6. を分子種に応じて数回繰り返す。得られたDNAをクローニング・シーケンシングする。	一本鎖 DNA のプールを作製する。標的分子を結合させたアフィニティカラムにアプライする。 DNA を溶出する。ビオチン標識プライマーを用いて PCR により DNA を増幅する。増幅した DNA を一本鎖 DNA にする。ストレプトアビジンカラムでアンチセンス鎖を除く。＊この過程でアンチセンス鎖を除ききれないケースがある。＊一本鎖 DNA はランダム領域とプライマー結合部位に相補性がある場合、部分的に二本鎖が形成されてしまい特異性の高いアプタマーが失われる可能性がある。 2. ～ 5. を 5～8 回繰り返す。得られた DNA をクローニング・シーケンシングする。

Dubbles selection strategy

SELEX 法

一本鎖 DNA のプール（10¹⁵）を作製する
（ランダムサイトの長さは 40 ヌクレオチド）。
標的分子を固定化したアフィニティカラムにアプライする。
バッファーで洗浄して弱い結合の DNA を洗い流す。また、標的分子と類似構造を有する分子をアプライするカウンターセレクションを行い、特異性の低い DNA を除く。
過剰量の標的分子で DNA を溶出することで、固定化した分子だけでなくフリーな分子にも結合する DNA を分離する。
PCR により DNA を増幅する。
増幅した二本鎖 DNA を熱変性させた後に再度アニールさせることで得られる DNA は両端の相補的な部位のみで二本鎖を形成し、ランダム領域は一本鎖の状態が保たれる。この二本鎖オリゴを「Dubbles」と呼び、二本鎖のまま再度カラムにアプライすることが可能。SELEX 法のネックである一本鎖 DNA の調製過程を省くことができる。
2. ～ 6. を分子種に応じて数回繰り返す。
得られたDNAをクローニング・シーケンシングする。

一本鎖 DNA のプールを作製する。
標的分子を結合させたアフィニティカラムにアプライする。
DNA を溶出する。
ビオチン標識プライマーを用いて PCR により DNA を増幅する。
増幅した DNA を一本鎖 DNA にする。
ストレプトアビジンカラムでアンチセンス鎖を除く。
＊この過程でアンチセンス鎖を除ききれないケースがある。
＊一本鎖 DNA はランダム領域とプライマー結合部位に相補性がある場合、部分的に二本鎖が形成されてしまい特異性の高いアプタマーが失われる可能性がある。
2. ～ 5. を 5～8 回繰り返す。
得られた DNA をクローニング・シーケンシングする。

How aptamers are selected

Problems with SELEX

Dubbles, an improvement on SELEX

Introduction to aptamer statistics

FRELEX 法 –新規 free/free セレクション

標的分子を固定化することなくアプタマーをセレクションできる FRELEX 法を開発し、特許出願を行っております。標的分子を固定化することには下記のデメリットがあります。

抗体のように大きなタンパク質であっても固定化することで構造が変化する。
固定化に伴いエピトープが失われてしまう。
小分子は固定化により全てのエピトープが失われる可能性がある。

上記の問題を解決する FRELEX 法は下記の手順で実施されます。

1 本鎖 DNA ライブラリーの両端に存在するプライマー認識部位にブロッカーを結合させ、アプタマー候補鎖のみが一本鎖を維持しているライブラリーを作成します。
1 cm² のゴールドチップ上に 8 mer のランダム配列を無数に結合させ、結合していない表面は thiolylated PEG でブロックしたチップを用意します。このチップに 1 本鎖 DNA ライブラリーを添加し、チップに結合しない DNA はウォッシュで除きます。
チップに結合した配列のみを溶出し、フリーな標的物質と混合して結合させます。この混合物を再度チップに添加し、チップに結合しなかった DNA のみを分離します。チップに結合しなかった DNA のみが標的物質と結合しているためです。
標的類似物質と 1 本鎖 DNA ライブラリーを混合してチップに添加し、チップに結合しなかった配列のみを分離するカウンターセレクションを行います。

アプタマー探索受託サービス

独自に開発した Dubbles selection strategy 法と次世代シーケンサーの活用により、ターゲットに高い親和性で結合するアプタマーを探索し、配列決定後に合成を行う受託サービスです。小分子や細胞、レセプター特異的なアプタマーも探索可能です。

アプタマー探索における次世代シークエンサー活用の優位性

サービス内容

サービス名称	サービス内容
アプタマーフルサービス	目標分子の固定化 Dubbles selection strategy 法によるアプタマーの探索（DNA or RNA） * 1 つの目標分子に対して 10¹⁵ ssDNA ライブラリーを 3 種類使用してスクリーニングを実施します。次世代シーケンサーによるアプタマーの配列解析選抜されたアプタマーのコンセンサス配列解析コンセンサス配列を有する全てのアプタマーの結合試験ターゲットに対し最も特異的なアプタマーの納品
アプタマーセレクション	目標分子の固定化 Dubbles selection strategy 法によるアプタマーの探索
アプタマー次世代シーケンス	シーケンス解析用に最大 12 種類のライブラリー調製 Illumina HiSeq 2500 によるシーケンス実施独自のソフトによりコピー数とモチーフ頻度の解析
アプタマーバインディングアッセイ (SPRi analysis)	最大 10 種類の候補配列を合成三種類の濃度で合成配列をゴールドチップに結合 5 種類の濃度で標的タンパク質をフローに注入バインディングカーブの分析 (各候補配列の ka、kd を計測してkD 値を決定)
アンチセンスプローブ作製	標的物質とアプタマーの kD 値にマッチしたアンチセンスプローブのデザインと合成 SPRi 分析による kD 値の確認標的物質とアンチセンスの競合置換の確認
エピトープ競合分析	1 タンパク質に対して最大 10 種類のリガンド (抗体かアプタマー) の競合分析リガンドをチップ上に固定 (SPRi 分析) ここのリガンドに分析対象物を添加競合結果の分析
アプタマー/抗体相互作用分析	最大 10 種類のアプタマー及び/又は抗体をチップに固定標的分子のローディング (SPRi 分析) フリーなアプタマー及び/又は抗体のローディングサンドイッチ結合分析
ELASA/ELISA 開発	マイクロタイタープレートにキャプチャーリガンド (アプタマー又は抗体) の固定標的分子の添加検出リガンド (ビオチン化) の添加 HRP ベースの分析方法開発濃度の最適化
アプタマートリミング	標的アプターに対して最大 10 種類のトランケートアプタマーのデザイン各トランケートアプタマーの結合活性試験実施結合試験結果の分析