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記事ID : 37037
研究用

遺伝子変異検出の効率化やNGS解析の高精度化を可能に!標的DNAのPCR増幅阻害用(ORNi-PCR®)カスタムオリゴリボヌクレオチド (ORN)作製サービス
遺伝子変異検出の効率化やNGS解析の高精度化を可能に!

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Oligoribonucleotide (ORN) interference-PCR (ORNi-PCR®)とは、20塩基程度の短いRNAを利用して、遺伝子変異及びゲノム編集細胞の検出や、細菌叢解析等で優占種由来のPCR増幅を阻害することによるNGS解析の高精度化・低価格化を可能にする技術です。ORNi-PCR®法では、標的とするDNA配列(野生型遺伝子配列情報や細菌固有のDNA配列)を基にカスタム設計したORNをPCR増幅反応時に添加することで、標的DNAの増幅を阻害し、変異型遺伝子を含むDNAや標的細菌以外のDNAを増幅します。

Epigeneron社では独自のノウハウ及び特許技術によりORNi-PCR®に用いるORNをカスタム設計し、納品します。

特長

  • 操作は簡便:
    • 標的DNAに対する相補的なORNをPCR増幅時に添加することで配列特異的に標的DNAのPCR増幅を阻害します(図1)。PCR増幅に使用するDNAポリメラーゼは、KOD、Pfu等のプルーフリーディング活性を有する酵素を使用できます(使用を検討されている酵素の使用可否については、見積もり時にご確認ください)。また、ORNは、RPA法やLAMP法等のDNA増幅法でも使用可能です。
  • 遺伝子変異の検出が可能(図2図3):
    • 野生型遺伝子の配列情報のみで、ニーズに合わせてORNを設計します。調製されたDNAサンプルにORNを添加した後、PCR増幅によりDNAが検出された場合、これは変異遺伝子配列を含むサンプルであると考えられます。ORNi-PCR®法では、点突然変異(置換、indel)を含む様々な変異の検出が可能です。変異遺伝子の配列はサンガー・シーケンス法により確認できます。
  • ゲノム編集(遺伝子編集)細胞の検出が可能(図4):
    • CRISPR/Cas9等のゲノム編集技術で使用されるgRNAからORNをカスタム設計します。ORNをPCR増幅時に添加し、増幅が確認された場合、ゲノム編集された細胞を含むサンプルであると考えられます。gRNAの配列情報からORNをカスタム設計するため、ゲノム編集後の配列情報は不要です。
  • NGS解析時のサンプル濃縮が可能(図5):
    • 宿主由来配列(rDNA等)や除去したいDNA情報に基づきORNをカスタム設計し、ライブラリの前処理におけるPCR反応においてORNを添加します。これにより解析対象となるDNAのみ含む最適なNGS用ライブラリの構築が可能となります。この最適化されたNGS用ライブラリをNGS解析することで、NGS解析の高精度化やリード数の削減が可能となります。

原理

ORNi-PCR(R)法の原理
図1.ORNi-PCR®法の原理

アプリケーション例

一塩基変異の検出

一塩基変異の検出01
293:293T細胞  1975:NCI-H1975細胞

図2.EGFR遺伝子のLeu858Argの周辺を標的とする野生型に対して相補的なORNを用いてPCRを行った。
ORN存在下では対立遺伝子にLeu858Arg変異を持つNCI-H1975細胞のみバンドが検出された。

一塩基変異の検出02
図3.シーケンス解析の結果、ORNによって野生型のPCR増幅が抑制されることが示唆された。

ゲノム編集細胞の検出

ゲノム編集細胞の検出
図4.PCR増幅時にORNを添加することで野生型は増幅されず、変異型の増幅が確認された。
点突然変異のような微細な変異で野生型と変異型のアンプリコン・サイズでの区別が難しくても、変異型のみが増幅されるため識別が容易となる。最終的にサンガー・シーケンス法による塩基配列決定に供する細胞クローンの迅速な選別が可能となり、多くの細胞クローンを培養する労力やスクリーニングコストの大幅な低減につながる。

NGS解析時のサンプルの濃縮が可能

NGS解析時のサンプルの濃縮が可能

図5.糞便検体から細菌叢DNAを抽出し、優占種由来の16S rRNAを標的とするORNによってPCR増幅を阻害することで、NGS解析においてこれまで検出が困難だった希少な菌種の検出が可能となった。

納品物

納品グレード:HPLCグレード
容量:PCR反応500回相当分

 

お見積り依頼

下記のリンクから見積のご依頼をお願いいたします。
配列情報を見積時に提供いただいた後、ORN配列デザインに必要な情報を確認させていただく場合があります。

ご注意:本サービスは研究用用途に限りご使用頂けます。商業用を目的とした使用を希望される場合はお気軽にご相談ください。

 

関連サービス

参考文献


  1. Tanigawa N, Fujita T, Fujii H, Oligoribonucleotide (ORN) interference-PCR (ORNi-PCR): a simple method for suppressing PCR amplification of specific DNA sequences using ORNs. PLoS One (2014) 9: e113345.
  2. Fujita T, Yuno M, Kitaura F et al., Detection of genome-edited cells by oligoribonucleotide interference-PCR. DNA Research (2018) 25: 395-407.
  3. Fujita T, Yuno M, Kitaura F et al., A refined two-step oligoribonucleotide interference-PCR method for precise discrimination of nucleotide differences. Scientific Reports (2018) 8: 17195.
  4. Fujita T, Motooka D, Fujii H, Target enrichment from a DNA mixture by oligoribonucleotide interference-PCR (ORNi-PCR). Biology Methods and Protocols (2019) 20, 4020.
  5. Baba K, Fujita T, Tasaka S et al., Simultaneous Detection of the T790M and L858R Mutations in the EGFR Gene by Oligoribonucleotide Interference-PCR. International Journal of Molecular Sciences (2019) 4, bpz009.

お問い合わせ先 : 創薬・受託サービス部

ご質問・ご不明の点は創薬・受託サービス部までお問い合せください。また、秘密保持契約のご希望につきましても、下記までご連絡をお願いいたします。

TEL
03-5632-9615
FAX
03-5632-9614
E-mail
jutaku_gr@cosmobio.co.jp

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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