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記事ID : 15719
研究用

無機リン酸(Pi)を定量的に検出リン酸測定アッセイ(蛍光)

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本製品は、96ウェルプレートフォーマットで、溶液、食品、細胞/組織ライセートサンプル中の総無機リン酸(Pi)量を測定する簡便な蛍光アッセイです。各キットにはブランク、リン酸スタンダード、内在性コントロール、未知サンプルを含む1000アッセイ分の試薬が含まれます。

背景

リン酸(Phosphate)について

遊離の可溶性リン酸塩として存在するリンは、無機リン酸(Pi/inorganic phosphate)と呼ばれ、アミノ酸代謝、タンパク質活性化、炭素代謝、細胞シグナリング、およびエネルギー移動などの多くの生物学的プロセスの調節に重要です。また、ATP、核酸、リン脂質、およびタンパク質の生合成にも使用されます。

特長

  • ライセート、溶液、食品、その他生物学的サンプルに適用
  • 検出限界:1.56μM リン酸
  • リン酸スタンダード付属

構成内容

  • リン酸スタンダード
  • 10X アッセイバッファー
  • 蛍光プローブ
  • HRP
  • マルトース
  • マルトースホスホリラーゼ
  • グルコースオキシダーゼ

アッセイ原理

本製品は、溶液、細胞培養上清、ライセート、食品サンプル中の総無機リン酸塩量を蛍光測定します。

無機リン酸(Pi)が存在すると、キットに含まれるマルトースは、マルトースホスホリラーゼ酵素によってグルコース-1-リン酸とグルコースに変換されます。続いて、グルコースがグルコースオキシダーゼによってD-グルコン酸と過酸化水素に変換されます。得られた過酸化水素は、その後特異性の高い蛍光プローブを用いて検出されます。プローブと過酸化水素は1:1で結合し、HRP(Horseradish peroxidase)がその反応を触媒します。

サンプルおよびスタンダードを3時間インキュベートし、次いで、標準的な96ウェル蛍光プレートリーダーで測定します。サンプル濃度は、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマット内のリン酸スタンダードと比較して算出されます。

リン酸測定アッセイの原理
図1. リン酸測定アッセイの原理

※サンプル中の内在性グルコースがアッセイに干渉する場合があるため、内在性コントロールを置いての実験を推奨します。

プロトコール

  1. キット使用前に全ての試薬を混合、調製してください。
    (サンプルおよびスタンダードの各試料はデュプリケートまたはトリプリケートでのアッセイを推奨します。)
  2. スタンダード50 μLを、蛍光プレートリーダー適合の黒色96ウェルプレート添加します。
  3. サンプル50μLを、異なる2ウェルに加えます。
  4. 「反応液ミックス((+)マルトースホスホリラーゼ)」50 μLを、全てのスタンダードウェルと、2つのサンプルウェルの片方に加えます。
  5. 「内在性コントロールミックス((-)マルトースホスホリラーゼ)」50 μLを、もう一方のサンプルウェルに加えます。
  6. よく混合し、遮光・37℃の条件で3時間インキュベートします。
    Note:このアッセイは、連続したものですが、反応速度に応じて複数の時点で測定できます。
  7. 蛍光マイクロプレートリーダーで測定します(励起:530-570 nm、蛍光:590-600 nm)。
  8. 反応液ミックスを添加したサンプル(ステップ4)のRFU値と、内在性コントロールサンプル(ステップ5)のRFU値の差を求めます。
  9. 測定サンプルのRFU値とスタンダードカーブを比較することで、サンプル内のリン酸濃度を計算します。

使用例


図2. リン酸スタンダードカーブ

リン酸測定アッセイ(蛍光)

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Phosphate Assay Kit (Fluorometric)詳細データ CBL STA-686 1000 ASSAY
¥77,000
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