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溶液除去や分離操作不要で高感度に検出 PhosphoWorks™ 蛍光ADPアッセイ

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メーカー名：AAT Bioquest, Inc. (Former ABD Bioquest, Inc.)

PhosphoWorks™ 蛍光ADPアッセイは、ADP形成を高感度にモニターするためのキットです。

背景

アデノシン二リン酸（ADP）とは、細胞代謝において主要な役割を果たす重要な有機分子です。それは、生細胞においてエネルギー移動に必須で重要な反応であるATP脱リン酸化の産物であり、再リン酸化を介してATPに再循環されます。ADPとATPのこの相互変換は、ホスファターゼ、ホスホリラーゼおよびキナーゼのようなATPアーゼにより主にミトコンドリアと葉緑体で起こります。ADPは血小板内の濃密体(dense body)に保存されており、血小板が活性化されると、ADPが放出されてプリン作動性受容体のファミリーと相互作用し、それによって細胞機能を調節します。

原理

酵素結合を利用した本アッセイでは、キナーゼ活性をモニターすることでADP形成を測定します。産生されるADPの濃度は酵素ホスホトランスフェラーゼ活性に比例し、ABD社独自のADPセンサーを使用してキナーゼ活性をモニターし、蛍光マイクロプレートリーダー（Ex/Em = 540/590 nm）で測定します。

特長

HTSアプリケーションに最適な「mix and read」フォーマット
96ウェルまたは384ウェルのマイクロタイタープレートに対応

構成内容

Component A: ADP Sensor Buffer, 1 vial (2 mL)
Component B1: ADP Sensor I (Light-sensitive), 1 vial powder
Component B2: ADP Sensor II, 1 vial (1 mL)
Component B3: DMSO, 1 vial (100 µL)
Component C: ADP Standard, 1 vial
Component D: ADP Assay Buffer, 1 vial (10 mL)

プロトコール概要

キナーゼ反応
ADPセンサーバッファーの添加
ADPセンサーの添加
室温で15分-1時間インキュベート
蛍光強度の測定

製品データ

図.1 PhosphoWorks™ 蛍光ADPアッセイキットを用いたADPの用量反応測定
分析機器：Gemini蛍光マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）
384ウェル黒色プレート使用, インキュベーション時間：15分、30分、1時間
0.3 µMのADPを検出（Z'ファクター= 0.65）。