シグナル伝達関連のタンパク質発現やリン酸化状態のサンプル間の差を抗体マイクロアレイで比較・検出する受託サービス Kinex™ リン酸化抗体マイクロアレイ受託サービス
Kinexus社；シグナル伝達関連のタンパク質発現やリン酸化状態のサンプル間の差を、約1325種類のシグナル伝達関連タンパク質抗体をスポットした抗体マイクロアレイで比較・検出する受託サービス

Kinex™リン酸化抗体マイクロアレイサービスは、シグナル伝達関連タンパク質抗体をスポットした抗体マイクロアレイの受託解析サービスです。処理済サンプルとコントロールサンプル間での発現タンパク質およびリン酸化状態の違いにより、使用した化合物、siRNA、ホルモンなどの効果がどのようなパスウェイに関与するかを検討できます。
マイクロアレイ解析は、データ解析が難しいことが知られていますが、Kinexus社では、得られたデータを基にしたパスウェイ解析が可能であり、ご希望パスウェイの変化をサンプル間で比較できます。

• ターゲットリスト：KAM-2023 Antibody List
  ※最新のターゲットリストはお問い合わせください。

• 高い信頼性：組織や細胞サンプル調製時に可溶化タンパク質に対してKinexus社独自のCemical Cleavage処理により偽陽性・偽陰性を抑制します。（Figure 3）
• 広範囲に網羅された抗体群：キナーゼ、ホスファターゼ、転写因子、細胞周期、ストレスおよびアポトーシス関連タンパク質に対する抗体がアレイされています。
• 6000種類を超える抗体を評価し、最適な抗体を使用
• 様々な動物サンプルで使用可能(Human, Mouse, Ratサンプル用に最適化しておりますが、Chicken, Bovine, Procine, Canine, Monkeyなどのサンプルでも使用実績がございます。)
  

Figure 1 スキャンイメージデータ (4 of 32 grids of Kinex™ antibody microarray)
赤、オレンジ、黄色、緑、青の順にシグナル強度が減少している。

Figure 2. Methodologies used in Kinex™ KAM Antibody Microarray.
Method 1：ライセートを直接蛍光色素で標識し、インキュベーションします。結合しなかったタンパク質を洗浄し、結合したもののみをスキャンします。
尚、この方法では、目的のタンパク質が複合体を形成していた場合、異なるタンパク質として検出される可能性あります。
Method 2及びMethod 3はいずれもトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）および2-ニトロ-5-チオシアナト安息香酸（NTCB）を用いてCystein 残基のChemical Cleavage(CCC)処理を行います。このCCC処理により、複合体を形成したタンパク質を解離し、キナーゼやホスファターゼ、プロテアーゼその他の酵素を失活させ、リン酸化部位が保存されたより安定なペプチドサンプルとして調製することができます。
Method 4では、サンプルをホモジネートする際にCCC処理します。ビオチン化タンパク質をマイクロアレイ上でキャプチャーした後、アレイは蛍光標識されたビオチン抗体でプローブされます。この方法は、他の方法にくらべ、バックグラウンドシグナルが低く、また、広いダイナミックレンジをもたらしますので、Kinexus社ではMethod 4を推奨しています。

Table.1 Effect of chemical cleavage on the detection of protein changes on the KAM antibody microarray using dye-labelled lysate proteins from epidermal growth factor-treated A431 cells.

Overnight, serum-starved A431 cells were treated with and without 100 nM EGF for 5 minutes prior to preparation of cell lysates. The lysates were dyelabeled either without or with prior chemical cleavage at cysteine (CCC). Note that in this study, the dye-labelling step was done first, and the chemical cleavage was subsequently performed afterward.

Figure 3. Scanned images of Kinex™ KAM-900P antibody microarrays following incubation with dye-labeled (top four panels) or biotin-labelled (bottom two panels) lysate proteins from serum-starved A431 human cervical carcinoma cells treated without (left panels) and with 100 nM epidermal growth factor for 5 minutes (right panels).
Top panels: no chemical cleavage; Middle and bottom panels : cysteine chemical cleavage (CCC) was performed at the time of homogenization of of the cells.

サンプル条件：2サンプル以上（例：未処理サンプル＋処理済みサンプル）、測定条件：n=2

1. 細胞ライセートまたは組織ライセートをサンプルとして使用
2. ライセート中のタンパク質を蛍光標識（proprietary Dye）
3. 標識済みのサンプルを、Kinex™抗体マイクロアレイに滴下
4. 各タンパク質が、特異的抗体に結合
5. 結合しなかった標識タンパク質を洗浄除去し、結合したタンパク質を測定
6. 陽性／陰性、擬陽性／擬陰性等を評価し、2サンプル間の差を比較

【納期】サンプルがメーカーに到着後、4〜5週間程度

• 定性試験：Kinex™抗体マイクロアレイの画像ファイル（TIFF及びJPEG形式）*上図参照
• 半定量試験：各タンパク質の蛍光強度と2サンプル間の平均変化率（Excel形式）

解析の一例

KAM-1325-Service_解析例

※ オプション（別途料金）により、Figure 4、Figure 5のようなKinetscape マップを作成することも可能です。

• 対象サンプル：細胞ペレット、組織サンプル※
• サンプル必要量：細胞 >2 x 10^6 cells、組織 数mg
  （ライセート処理後にタンパク質量100µg/サンプルが必要）
• サンプル調製方法：Sample_prep_Kinex

※タンパク質のリン酸化状態をライセートサンプル中で保存することは困難なため、 ライセ―ト処理はKinexus社で実施することを推奨しております。

ご提供いただくサンプルについては、インフォームド・コンセントが取得されており、かつドナーの個人情報が特定できないように匿名化されたものである必要がございます。

Kinet抗体マイクロアレイおよび、KINETWORKSイムノブロッティングサービスは、 数多くの大学・公的機関・企業で利用されおり、年々様々な研究分野への応用が報告されています。(2000年〜2014年までに報告された論文は、下記「引用論文リスト」をご参照下さい)

＜創薬研究分野例＞
ガン、糖尿病、アルツハイマー、炎症、アレルギー、エイズ、各種神経疾患

＜基礎医学分野例＞
再生医学( ES細胞)、ストレス、シグナル伝達、血管新生、代謝、発症メカニズム、抗酸化、細胞周期、プロテオミクス

サービス適用例

• 分化メカニズムの解明
• 疾患メカニズムの解明
• 応答性などのカスケード探索
• 化合物の薬剤効果
• 遺伝子治療・細胞治療効果の評価

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