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研究用

あらゆる動物種のライセートサンプルを用いた、網羅的キナーゼプロファイリングが可能!KiNativ™ in situ Kinase Profiling
ActivX社;あらゆる動物種のライセートサンプルを用いた、網羅的キナーゼプロファイリングが可能

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ActivX社のKiNativ™ in situ Kinase Profilingは、細胞ライセートから動物組織まで、様々なサンプル中に発現しているネイティブキナーゼに対する化合物スクリーニングプラットフォームです。
内在性の翻訳後修飾やタンパク質-タンパク質相互作用を保持している状態の完全長キナーゼに対するオン/オフターゲットプロファイリングは、in vivo活性と相関性の高いデータをご提供致します。

特長

  • 細胞や組織ライセートをサンプルとした、タンパク質相互作用や翻訳後修飾を保持した状態での、プロファイリングおよびIC50値の算出
  • 動物種を問わず、あらゆる細胞や組織に対しての化合物スクリーニング
  • リコンビナントキナーゼアッセイよりも in vivo の結果に相関性の高いデータの算出
  • 直接的結合アッセイによりタイプIおよびタイプIIキナーゼ阻害剤の両方を試験可能
  • Heat Shock ProteinsやABCトランスポーターなど、キナーゼ以外のATP結合タンパク質に対する評価も可能

In Situ キナーゼプロファイリング用 KiNativ™ プローブの原理

ActivX社のKiNativ™では、ビオチン-アシルリン酸 (特許取得済み*) 標識のヌクレオチドプローブ (ATP or ADP) を利用します。KiNativ™プローブがキナーゼのATP結合部位に結合すると、ATP結合部位に共通して保存されているリジン残基のアミノ酸が、近接するプローブのアシルリン酸の炭素骨格と置換反応を起こし、アミド結合を介してキナーゼがビオチンに標識されます(Fig. 1)。
ビオチン標識されたキナーゼをトリプシン処理およびストレプトアビジンによる精製の後、LC-MS/MSによって標識されたリジン基近傍のアミノ酸配列を決定し、標識されたキナーゼ分子を同定します。さらに目的化合物での処理サンプル、および非処理サンプル間でシグナル強度を検出・比較し、阻害率を算出します(Fig. 2)。 
*US Patent #7,365,178

In Situ キナーゼプロファイリング用 KiNativ(TM) プローブ
(Fig. 1)  In Situ キナーゼプロファイリング用 KiNativ™ プローブ

強力な再現性のあるキナーゼ活性プロファイリング

(Fig. 2) 強力な再現性のあるキナーゼ活性プロファイリング
Patricelli et. al. (2007) Biochemistry 46, 350-358

KiNativ™ で可能な試験

様々な細胞株や組織に発現しているネイティブキナーゼに対する化合物のインヒビタープロファイリングおよびIC50値の算出

  • 細胞株: A549、DU145、MD-MB-231、HL60、PBMC、Ramos、PC3、Jurkat、THP-1、HCT-116、HEK293T、A375、HeLa、HuH7、MV-4-11、U2OS、BCWM.1、COLO-205
  • ラット組織: brain、WBC
  • マウス組織: brain、spleen

※ お客様の細胞または動物組織サンプルからカスタムオーダーにてターゲットリストを作成する事も可能です。
※ ヒト、イヌ、ラット、マウス組織での幅広い経験がございますので詳細はお問い合わせください。

試験結果例 (IC50値評価)
(Fig. 3) 試験結果例 (IC50値評価)
様々なセルライセートにおいて、Iressa(上)とStaurosporine(下)のIC50値を算出した (at 3-fold dilutions ranging from 30 uM to 0.001 uM)。 

KiNativ(TM) のインヒビタープロファイリング例
(Fig. 4) KiNativ™ のインヒビタープロファイリング例
HL60細胞およびPC3細胞を用いて6種のインヒビターについてプロファイリングを行い、阻害活性がみられたキナーゼをここに示した。

TAK1インヒビターの評価
(Fig. 5) TAK1インヒビターの評価
3種類のTAK1インヒビターを、リコンビナントキナーゼアッセイ、KiNativ™、およびセルベースリン酸化アッセイを用いて評価した。リコンビナントキナーゼアッセイでは、3種類全てのインヒビターに対して強力な阻害活性が示されたが、KiNativ™ ではInh. #1のみ高い阻害活性を示し、セルベースリン酸化アッセイとの良好な相関を示した。

B-Rafの阻害剤に対する評価結果の比較
(Fig.6) B-Rafの阻害剤に対する評価結果の比較
5種類のB-Raf阻害剤を、B-Raf (V600E) のリコンビナントアッセイ、A375細胞を使用したKiNativ™、A375細胞の増殖アッセイ、およびB-Rafによりリン酸化されるERKのWestern Blot 解析によって評価した。リコンビナントアッセイでは、GW5074が最も強力な阻害剤であると示されたが、KiNativ™ では活性の低い阻害剤として示され、A375細胞増殖アッセイおよびWestern Blotでは阻害しない事が示された。また、KiNativ™ データは、全ての化合物について、細胞増殖アッセイおよびWestern Blotの結果とよく相関している事が示された。

In vivo効果を正確に予測
(Fig. 7) In vivo効果を正確に予測
GleevecとDasatinibにおける評価比較
A社およびKiNativ™のデータを、報告されている細胞内自己リン酸化アッセイのEC50値と比較した。A社およびKiNativ™ は両方ともin vivo活性との相関性があるが、KiNativ™ の方がより正確な数値を示した。
* Manley, PW; et. al., Biochim. Biophys. Acta, 2005 Dec 30; 1754(1-2):3-13
** Du, J; et. al., Nat. Biotechnol. 2009 Jan; 27(1):77-83

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