記事ID ： 761

20Sプロテアソームのプロテアーゼ活性を蛍光により測定するキット Proteasome 20S assay kit

メーカー名：Enzo Life Sciences,Inc.

非放射性の蛍光ペプチド基質を用いて、精製された20Sプロテアソームのキモトリプシン様プロテアーゼ活性を測定するためのキットです。96-wellアッセイは、20Sプロテアソームのインヒビター、あるいはモジュレーターのスクリーニングに有用です。

タンパク質分解活性の測定は、蛍光基質（Suc-LLVYAMC）の分解により生じる AMC の蛍光（Ex. 360nm／Em. 460nm）に基づいており、非放射性で高感度、かつ基質分解をリアルタイムで観察できる利点があります。

キットに含まれるインヒビター（epoxomicin）は、20Sプロテアソームキモトリプシン様活性の迅速かつ強力な不可逆的インヒビターです。

Proteasome 20S assay kit

背景

20S プロテアソーム

タンパク質分解は、細胞内制御のメカニズムにおいて非常に重要です。20Sプロテアソームは、全ての哺乳類に存在する700kDaの多量体のタンパク質分解酵素で、ユビキチン化タンパク質を分解する26Sプロテアソームの活性中心です。20Sプロテアソームは、ポリユビキチン化されたタンパク質を分解するために、20Sプロテアソームの末端リングに結合して26Sプロテアソームを形成する、PA700もしくは19S capと呼ばれる別のタンパク質を必要とします。PA700は、立体構造を変化させることにより、プロテアソームの中央の空洞への基質のアクセシビリティーを制御します。この過程では、ATPの加水分解が行われているかもしれません。

真核生物の20Sプロテアソームに対しては、次の3つの主なタンパク質分解活性が明らかにされています。

大きな、疎水性残基の後ろを分解する、キモトリプシン様活性。
塩基性残基の後ろを分解する、トリプシン様活性。
酸性残基の後ろを分解する、ペプチジル-グルタミルペプチド加水分解活性。

20Sプロテアソームペプチダーゼ活性は、構造変化によってその応答を導くPA28（11Sレギュレーター）タンパク質の結合により、著しく促進されます。また、低濃度のSDSによるわずかな変性によっても活性化されることが、実験的に示されています。

構成内容

20S プロテアソーム酵素（human, erythrocyte）
基質（Suc-LLVY-AMC; MW=763.9）
20S プロテアソームアッセイバッファー
SDS
インヒビター（Epoxomicin; MW=554.7）
スタンダード（7-amino-4-methylcoumarin; MW=175.1）
1/2 volume 白色マイクロプレート

使用例

（画像はクリックで拡大されます）

図1　20Sプロテアソームによる Suc-LLVY-AMC 開裂のキネティクス
20Sプロテアソーム（0.1μg）を記載された濃度の Suc-LLVY-AMC とインキュベート（25℃、19分）し、1.27 min で蛍光測定。プレートリーダーのインターバル（Ex360nm、Em460nm）。Rate (v) は蛍光プロットのスロープ対時間より決定され、AMCスタンダードカーブより pmol/min に変換されています。各ポイントは2測定の平均を表しています。線、Km 値、Vmax 値はミカエリス・メンテン式より得られています。
A. Assays performed in Assay Buffer (BML-KI340)
B. Assays performed in Assay Buffer (BML-KI340) plus 0.03% SDS

参考文献

Epoxomicin, a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity.: L. Meng et al.; PNAS 96, 10403 (1999), Abstract; Full Text
The proteasome, a novel protease regulated by multiple mechanisms.: G. N. DeMartino & C. A. Slaughter; J. Biol. Chem. 274, 22123 (1999), Abstract; Full Text
Kinetic studies of the branched chain amino acid preferring peptidase activity of the 20S proteasome: development of a continuous assay and inhibition by tripeptide aldehydes and clasto-lactacystin beta-lactone: T. A. McCormack et al.; Biochemistry 37, 7792 (1998), Abstract;
Catalytic properties of 26 S and 20 S proteasomes and radiolabeling of MB1, LMP7, and C7 subunits associated with trypsin-like and chymotrypsin-like activities.: J. Reidlinger et al.; J. Biol. Chem. 272, 24899 (1997), Abstract; Full Text
Kinetic characterization of the chymotryptic activity of the 20S proteasome.: R. L. Stein et al.; Biochemistry 35, 3899 (1996), Abstract;
Multicatalytic endopeptidase complex: proteasome.: A. J. Rivett et al.; Methods Enzymol. 244, 331 (1994), Abstract;