タンパク質調製に細胞は必要ありません!!PUREfrex® 酵素的 無細胞タンパク質合成キット

PUREfrex® は、タンパク質合成に必要な因子のみを個別に精製し、アミノ酸や NTP 等と混合して再構築したタンパク質合成キットです。
キットに含まれる大腸菌由来のリポ多糖が低減されていますので、合成したタンパク質を精製せずに、細胞を用いた実験やアッセイに直接用いることができます。
はじめて無細胞系をお試しになる方におすすめの少量サイズの商品もございます。

PUREfrex® とは

PURE systemにおけるタンパク質合成

PUREfrex® は、PURE system を基に開発された再構成型無細胞タンパク質合成キットです。PURE system は、東京大学大学院の上田卓也教授のグループにより開発された再構成型無細胞タンパク質合成系で、転写・翻訳・エネルギー再生に必要なタンパク質、リボソームを個別に精製した後、アミノ酸、NTP などと混合した合成系です。反応液に、目的のタンパク質をコードする DNA もしくは mRNA を添加して反応することにより、タンパク質を合成します。精製した因子を混合した反応液を使用するため、組成を自由に調節できる、翻訳などに無関係なタンパク質をほとんど含まないなどの特長があります。

PUREfrex® は、反応液に含まれるタンパク質、リボソーム、tRNA の調製方法を改良し、従来品に比べて純度を高めた合成反応液です。特に、混入していた大腸菌由来のリポ多糖は、反応液 1 µL あたり 10^-1 EU 以下にまで低減されています。また、RNase、βガラクトシダーゼなどの混入タンパク質も減少しています。さらに、PUREfrex®に含まれる翻訳因子などのすべてのタンパク質には、精製、検出用のタグ配列が付加されていません。そのため、あらゆるタグ配列を付加したタンパク質を合成し、タグにより精製・検出を行うことが可能です。

• 細胞の抽出液ではなく、精製した因子を再構成した反応液です。
• 複数鋳型を混在して反応させ、Fab等、多量体の合成もできます。（複数鋳型混在下におけるFabの合成例）
• 生細胞では難しい、毒性の強いタンパク質も合成できます。（タンパク毒素の合成例）
• 鋳型DNAは、PCR反応液を直接添加してお使いいただけます。
• 反応液量あたりの合成量はほとんど変わりません（数 µL〜数 10 mL）。
• 操作は簡単。ワンチューブで、37℃、数時間で合成されます。
• タグによる合成タンパク質の精製・検出が可能です。

プロトコル例

PUREfrex®1.0 を用いたタンパク質合成は、任意の反応液量で行うことができます。
例えば、20µLで行う場合は以下のように反応液を調製してください。

1. Solution Iを、室温〜37℃で1分間ほど温めて完全に融解し、氷上に置きます。
2. Solution IIとSolution IIIを氷上で融解します。
3. 融解したSolution I、IIおよびIIIを軽くボルテックスした後、遠心して内容物をチューブ下部に集めます。
4. 以下のように反応液を調製します。(DNAは、1kbpあたり0.5-3 ng/µLになるように添加してください。)

   Water	8-X µL
   Solution I	10 µL
   Solution II	1 µL
   Solution III	1 µL
   鋳型DNA 注1	X µL
   Total	20 µL

5. 37℃のヒートブロック又はウォーターバスで2〜4時間反応させて、タンパク質を合成します。^注2
6. 合成されたタンパク質を、それぞれの目的に使用します。^注3

タンパク質合成は、本キットの Solution I、II、III を混合した反応液に、鋳型 DNA を添加し、転写・翻訳反応を同時に行います。
そのため、PUREfrex®での合成に適した鋳型 DNA の作製がタンパク質合成に重要なカギの一つになります。 より詳しい調製方法に関しましては、鋳型DNAのサイトをご覧ください。

PUREfrex®を用いたタンパク質合成に適した鋳型DNAの設計する際のポイント

• ORF全体：
  大腸菌のコドン使用頻度に基づいたコドンを使用する
  フレームシフトを生じる配列（X/XXY/YYZなど）は除く
• N末端：
  ATリッチコドンを使用する
  開始メチオニン直後のプロリンやグリシンはできるだけ避ける
  
• 5’UTR：
  SD配列（リボソーム結合配列）を含む
  SD配列上流のATリッチ配列を15塩基以上含む
  

タンパク質発現を行うとき、宿主、発現ベクター、誘導、不溶化など、検討することは意外と多くあります。
はじめてPUREfrex®を使う方、はじめて無細胞系をお試しになる方は、本当に合成できるのか、合成できたとしても合成量が少ないのではないかなどの不安を抱えている方もいらっしゃると思います。
PUREfrex® は、どんな生物由来のタンパク質でも鋳型の構成は同じなので、宿主やベクターの検討も不要 です。全タンパク質共通のプライマーや詳細な解説が付いた、PUREfrex® 2.0 mini で、まずは、お客様のタンパク質が合成できるかどうかお試しください。合成ができなかった場合も、サポートいたします。

用途に合わせてタンパク質合成反応液・添加剤をお選びください。

タンパク質合成反応液

• PUREfrex®1.0
  PUREfrex® 1.0は、反応液の組成が公開されているため、カスタム品をお考えなど、構成内容の情報が必要な場合にお奨めします。また、PUREfrex 2.0でタンパク質を合成した際合成速度が速くて、ジスルフィド結合形成やフォールディングなどが間に合わずに不溶化してしまう場合には、合成速度が遅い PUREfrex® 1.0での合成が有効な場合があります。
  （反応液の組成はこちら ）
• PUREfrex®2.0
  PUREfrex®2.0は、PUREfrex® 1.0 の反応液組成を見直し、タンパク質の合成効率を増大させるよう改良した結果、反応液当たりのタンパク質合成量が高くなっています。より多くのタンパク質を必要とする場合や多品種のタンパク質解析を必要とする研究にお奨めします。反応液組成は非公開となっています。
  • 合成量の比較データ
  • 添加剤の効果の比較データ
• PUREfrex®2.1
  PUREfrex® 2.1は、酸化還元状態のコントロールが重要となる、ジスルフィド結合を含むタンパク質の合成にお奨めします。PUREfrex® 2.0の反応液組成をそのままに、還元剤を別添したことにより、添加する還元剤（及び酸化剤）の種類や量により、合成時の酸化還元状態を調整できます。これにより、例えば、細胞での発現では難しいジスルフィド結合を含むタンパク質合成に最適な条件も検討できます。また、添加剤である、DsbC Set (旧：DS supplement)やDnaK Mix も反応液に添加して使用できます。
  • AppAの合成例およびIgGの合成例

添加剤
（ジスルフィド結合形成やシャペロンを必要とするタンパク質や連続したプロリン残基を含むタンパク質に）

• DsbC Set (旧：DS supplement)
  DsbC Setは、PUREfrex®反応液に添加することで、ジスルフィド結合形成に最適な環境を作り出します。DsbC Setは、酸化的な環境にするための酸化剤として、酸化型グルタチオン（GSSG）、ジスルフィド結合イソメラーゼとして大腸菌のDsbCが含まれています。タンパク質の活性にジスルフィド結合が必要な場合にお使いください。
• DnaK Mix
  DnaK Mixは、高度に精製した大腸菌由来のDnaK、DnaJ、GrpEを適切な濃度比であらかじめ混合した溶液です。PUREfrex®反応液、またはDsbC Setを用いたタンパク質合成時に添加することにより、単独では高次構造を形成しにくいタンパク質を、活性を有した状態で合成しやすくします。
• GroE Mix
  GroE Mixは、高度に精製した大腸菌由来のGroEL、GroESを適切な濃度比であらかじめ混合した溶液です。PUREfrex®反応液を用いたタンパク質合成時に添加することにより、単独で高次構造を形成しにくいタンパク質を、活性を有した状態で合成しやすくします。
• PDI Set
  PDI Setは、ジスルフィド結合形成が可能な環境にするための酸化剤として酸化型グルタチオン（GSSG）、ヒト由来のジスルフィド結合イソメラーゼ（PDI）、及び PDI の酸化酵素である Ero1α が含まれています。PUREfrex®反応液を用いたタンパク質合成時に添加することで、正しいジスルフィド結合を形成して活性を有したタンパク質を合成しやすくします。
• EF-P
  EF-Pは、34位リジンに翻訳後修飾を受けた大腸菌由来の組換えタンパク質を含む、タンパク質合成用添加剤です。連続したプロリン残基（Pro-Pro-ProやPro-Pro-Glyなど）を含むタンパク質は、大腸菌の転写・翻訳反応に関与する因子で構成されているPUREfrex®での合成が難しいことや、合成量が低い場合がありますが、EF-P を添加することで合成量を改善することができます。

PUREfrex®1.0と2.0の合成量の比較

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原核生物および真核生物由来のタンパク質を合成した結果、PUREfrex®2.0 で合成した場合、様々なタンパク質でPUREfrex®1.0 に比べて合成量が増大していることが確認できました。

添加剤の効果の比較

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ジスルフィド結合（SS結合）が必要な大腸菌酸性フォスファターゼ（AppA）をPUREfrex®2.0ベースにDS supplement を添加して合成した結果、酸化剤やジスルフィド結合イソメラーゼの存在下で活性タンパク質合成量の向上が確認できました。

正しい高次構造の形成に分子シャペロンが必要なタンパク質を合成した結果、PUREfrex®2.0 で合成した場合、分子シャペロン存在下で活性タンパク質合成量の向上が確認できました。

複数の異なる鋳型DNAをワンチューブで合成

複数鋳型混在下でDsbC Set (旧：DS supplement)を添加したFabの合成例

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軽鎖 (LC) と重鎖 (HC) が分子間でジスルフィド結合して活性型となるFabをPUREfrex®2.0ベースにDS supplemantを添加して合成した結果、抗原と結合できる活性型のFabが合成できていることが確認できました。さらに、軽鎖 (LC) と重鎖 (HC) の鋳型DNAの添加する比率を最適化することで、活性型のFabの収量が上がることも確認できました。（最大収量 0.5 mg/mL）

毒性の強いタンパク質の合成

タンパク毒素（Gelonin）の合成例

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a) Gelonium multiflorumという植物の種子由来のタンパク毒素（Gelonin）をPUREfrex®2.0で合成した結果、タンパク質の翻訳阻害活性を示す毒素が合成されていることが確認できました。
b) 翻訳阻害の活性確認は、HeLa細胞由来の無細胞発現系でGFPを合成させる際、Geloninを合成させたPUREfrex®の反応液（未精製）を添加した場合のGFP活性を比較して行いました。Geloninは、分子量が30kDaで真核細胞のリボソームを不活化させることで翻訳を阻害します。（最大収量 0.5 mg/mL）

開始コドン直下のアミノ酸コドンの合成量への影響

開始コドン直下のコドンを置換した Trastuzumab 重鎖 (VH+CH1) の合成例

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Trastuzumab の重鎖（VH+CH1）について、開始コドン直後の2〜6 番目のアミノ酸で異なるコドンを使用した56 種類の鋳型DNA から、PUREfrex?2.0 を用いて合成 して合成量を比較しました。その結果、最大と最小で約 50 倍の合成量の差が確認されました。最大の合成量を示した鋳型DNA は、GC 含量が少なくなるコドンを 使用した鋳型DNA（AT）で、GC 含量が高くなるに従って合成量が減少しました。また、大腸菌で使用頻度が高いコドンよりも、使用頻度が低くても GC 含量が少 ないコドンを使用した鋳型DNA から合成したときに、合成量が高くなることも確認されました。

PUREfrex®2.1によるジスルフィド結合が必要なタンパク質の合成

1. 酸性ホスファターゼ（AppA）の活性

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ジスルフィド結合（SS結合）が必要な大腸菌AppA^*1を、2種類の還元剤、DTTとGSH（還元型グルタチオン）を用い、濃度を振ったGSSG（酸化型グルタチオン）と大腸菌のジスルフィドイソメラーゼであるDsbCを添加して合成し、その合成量と活性を比較した結果、還元ゲルの泳動解析から合成量に大きな違いは見られなかったものの、活性は使用する還元剤の種類と濃度により異なることがわかりました。
（*1 AppAはジスルフィド結合が5ヶ所存在し、その内、1ヶ所が連続していないシステイン間でのジスルフィド結合です。）

2. IgG の形成

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ジスルフィド結合（SS結合）により、2本のL鎖（軽鎖）と2本のH鎖（重鎖）の4量体構造を形成する IgG を、異なる種類の還元剤を用い、GSSG（酸化型グルタチオン）、大腸菌のジスルフィドイソメラーゼであるDsbC、分子シャペロンを添加して合成し、その合成量と活性を比較した結果、還元ゲルの泳動解析から合成量に大きな違いは見られなかったものの、活性は使用する還元剤の種類により異なることがわかりました。

この他にも様々な無細胞タンパク質の合成例のデータがございます。
詳しくはこちらをご参照ください。

• タンパク質合成について
• 鋳型DNAについて

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