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記事ID : 15123
研究用

GTPase(GTPアーゼ)のヌクレオチド交換を蛍光により測定RhoGEF exchange アッセイキット

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RhoGEF(グアニンヌクレオチド交換因子)exchange アッセイキットは、GTPase(GTPアーゼ)のヌクレオチド交換を蛍光により測定するキットです。
96ウェル/384ウェルフォーマットでご使用いただけます。

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背景

グアニンヌクレオチド交換因子(GEF: Guanine nucleotide Exchange Factor)

低分子量 GTPaseの Ras スーパーファミリー(例: Ras、Rho、Rab、Arf、Ran タンパク質)は、GDP結合型の「不活性化状態」と、GTP結合型の「活性化状態」とを循環するスイッチとして機能します。細胞内では、主に2種類の調節タンパク質によって、この2つの状態の循環が制御されています。活性化に関与するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF: Guanine nucleotide Exchange Factor)と、不活性化に関与する GTPase 活性化タンパク質(GAP: GTPase Activating Protein)です。

GEF は、ターゲットとなる GTPase のヌクレオチド交換反応を触媒します。GEF がヌクレオチド結合型 GTPase に結合すると、結合したヌクレオチドが放出され、ヌクレオチドフリー型の GEF-GTPase 中間体が生成されます。このヌクレオチドフリー型複合体は、GEF が GTPase から放出された後、新しいヌクレオチドを取り込みます。GEF は一般的に、GTP 結合型 GTPase よりも GDP 結合型 GTPase により親和性が高く、細胞内における GTP と GDP の比率は約 10:1 であることから、GEF は GDP 結合型 GTPase から GTP 結合型 GTPase への交換を促進します。

GTPase molecular switch

使用目的

  • 未同定の GEF に特異的な GTPase 活性の測定
  • 低分子量 GTPase および GEF の生化学的検討
  • 様々なコファクターやタンパク質ドメインによる GEF 活性の調節の検討
  • GEF 変異タンパク質/GTPase 変異タンパク質の活性や基質特異性のスクリーニング
  • ハイスループットスクリーニング(HTS)による GEF 阻害剤の同定

構成内容

本キットには、96ウェルプレートで 20アッセイ/各 GTPase、384ウェルプレートで 100アッセイ/各 GTPase 分の試薬が含まれています。

  • Exchange バッファー
  • His-tagged Cdc42 タンパク質
  • His-tagged Rac1タンパク質
  • His-tagged RhoA タンパク質
  • His-tagged hDbs タンパク質(GEF のポジティブコントロール)
  • 384 ウェル 黒 ハーフエリア 丸底プレート
  • 96 ウェル 黒 ハーフエリア 平底プレート

その他 必要な機器

  • 蛍光マイクロプレートリーダー(励起: 360 nm、蛍光: 440 nm)

測定原理

本キットは、蛍光ヌクレオチドアナログ N-methylanthraniloyl-GTP(mant-GTP)の GTPase への取り込みを測定します。取り込まれた量は、フリーと GTPase 結合 mant-GTP との差を分光法により測定することが可能です。mant-GTP が GTPase のヌクレオチド結合ポケットに結合すると、蛍光(励起: 360 nm、蛍光: 440 nm)が大幅に増大します(1、2)。
したがって、低分子量 GTPase 存在下での mant-GTP の蛍光強度の増大は、GTPase によるヌクレオチドの取り込み(またはすでに結合しているヌクレオチドとの交換)を示します。

使用例

Dbs(GEF のポジティブコントロール)の Cdc42、RhoA、Rac1 に対する交換活性を、96/384ウェルプレートを用いて測定した(図1、2)。
Dbs は、Cdc42 および RhoA に対しては高いGEF活性を示すが、Rac1 に対する活性は非常に低い。

図1 Dbs の Cdc42、RhoA、Rac1 の対する交換活性を、96ウェルハーフエリアプレートを用いて測定

図1 Dbs の Cdc42、RhoA、Rac1 の対する交換活性を、96ウェルハーフエリアプレートを用いて測定

図2 Dbs の Cdc42、RhoA、Rac1 の対する交換活性を、384ウェルプレートを用いて測定

図2 Dbs の Cdc42、RhoA、Rac1 の対する交換活性を、384ウェルプレートを用いて測定

参考文献

  1. John, J., Sohmen, R., Feuerstein, J., Linke, R., Wittinghofer, A., and Goody, R. S. (1990) Kinetics of interaction of nucleotides with nucleotide-free H-ras p21. Biochemistry 29, 6058-6065.
  2. Leonard, D. A., Evans, T., Hart, M., Cerione, R. A., and Manor, D. (1994) Investigation of the GTP-binding/GTPase cycle of Cdc42Hs using fluorescence spectroscopy. Biochemistry 33, 12323-12328.

RhoGEF Exchange アッセイキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RhoGEF Exchange Assay詳細データ CYT BK100 1 KIT
[60-300 assays]
納期未定
¥176,000

【関連商品】 Rho GAP アッセイキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Rho GAP Assay Kit (non-radioactive)詳細データ CYT BK105 1 KIT
[80-160 assays]
¥176,000

製品使用文献

  1. Moey et al., 2011. Ginseng (Panax quinquefolius) attenuates leptin-induced cardiac hypertrophy through inhibition of p115RhoGEF-RhoA/ROCKdependent MAPK pathway activation. J. Pharmacol. Exp. Ther. doi:10.1124/jpet.111.182600.
  2. Oliver et al., 2011. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. Br. J. Cancer. 104, 324-331.
  3. Guilluy et al., 2010. The Rho exchange factor Arhgef1 mediates the effects of angiotensin II on vascular tone and blood pressure. Nat. Med. 16, 183-190.
  4. Arbeloa et al., 2010. EspM2 is a RhoA guanine nucleotide exchange factor. Cell. Microbiol. 12, 654-664.
  5. Kim et al., 2009. Dipeptidyl Peptidase IV Inhibition With MK0431 Improves Islet Graft Survival in Diabetic NOD Mice Partially via T-Cell Modulation. Diabetes. 58, 641-651.
  6. Li et al., 2009. PLC-gamma1 and Rac1 Coregulate EGF-Induced Cytoskeleton Remodeling and Cell Migration. Mol. Endocrinol. 23, 901-913.
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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