GTPase（GTPアーゼ）のヌクレオチド交換を蛍光により測定 RhoGEF exchange アッセイキット

RhoGEF（グアニンヌクレオチド交換因子）exchange アッセイキットは、GTPase（GTPアーゼ）のヌクレオチド交換を蛍光により測定するキットです。
96ウェル／384ウェルフォーマットでご使用いただけます。

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グアニンヌクレオチド交換因子（GEF： Guanine nucleotide Exchange Factor）

低分子量 GTPaseの Ras スーパーファミリー（例： Ras、Rho、Rab、Arf、Ran タンパク質）は、GDP結合型の「不活性化状態」と、GTP結合型の「活性化状態」とを循環するスイッチとして機能します。細胞内では、主に2種類の調節タンパク質によって、この2つの状態の循環が制御されています。活性化に関与するグアニンヌクレオチド交換因子（GEF： Guanine nucleotide Exchange Factor）と、不活性化に関与する GTPase 活性化タンパク質（GAP： GTPase Activating Protein）です。

GEF は、ターゲットとなる GTPase のヌクレオチド交換反応を触媒します。GEF がヌクレオチド結合型 GTPase に結合すると、結合したヌクレオチドが放出され、ヌクレオチドフリー型の GEF-GTPase 中間体が生成されます。このヌクレオチドフリー型複合体は、GEF が GTPase から放出された後、新しいヌクレオチドを取り込みます。GEF は一般的に、GTP 結合型 GTPase よりも GDP 結合型 GTPase により親和性が高く、細胞内における GTP と GDP の比率は約 10：1 であることから、GEF は GDP 結合型 GTPase から GTP 結合型 GTPase への交換を促進します。

• 未同定の GEF に特異的な GTPase 活性の測定
• 低分子量 GTPase および GEF の生化学的検討
• 様々なコファクターやタンパク質ドメインによる GEF 活性の調節の検討
• GEF 変異タンパク質／GTPase 変異タンパク質の活性や基質特異性のスクリーニング
• ハイスループットスクリーニング（HTS）による GEF 阻害剤の同定

本キットには、96ウェルプレートで 20アッセイ／各 GTPase、384ウェルプレートで 100アッセイ／各 GTPase 分の試薬が含まれています。

• Exchange バッファー
• His-tagged Cdc42 タンパク質
• His-tagged Rac1タンパク質
• His-tagged RhoA タンパク質
• His-tagged hDbs タンパク質（GEF のポジティブコントロール）
• 384 ウェル 黒 ハーフエリア 丸底プレート
• 96 ウェル 黒 ハーフエリア 平底プレート

その他　必要な機器

• 蛍光マイクロプレートリーダー（励起： 360 nm、蛍光： 440 nm）

本キットは、蛍光ヌクレオチドアナログ N-methylanthraniloyl-GTP（mant-GTP）の GTPase への取り込みを測定します。取り込まれた量は、フリーと GTPase 結合 mant-GTP との差を分光法により測定することが可能です。mant-GTP が GTPase のヌクレオチド結合ポケットに結合すると、蛍光（励起： 360 nm、蛍光： 440 nm）が大幅に増大します（1、2）。
したがって、低分子量 GTPase 存在下での mant-GTP の蛍光強度の増大は、GTPase によるヌクレオチドの取り込み（またはすでに結合しているヌクレオチドとの交換）を示します。

Dbs（GEF のポジティブコントロール）の Cdc42、RhoA、Rac1 に対する交換活性を、96/384ウェルプレートを用いて測定した（図1、2）。
Dbs は、Cdc42 および RhoA に対しては高いGEF活性を示すが、Rac1 に対する活性は非常に低い。

図1 Dbs の Cdc42、RhoA、Rac1 の対する交換活性を、96ウェルハーフエリアプレートを用いて測定

図2 Dbs の Cdc42、RhoA、Rac1 の対する交換活性を、384ウェルプレートを用いて測定

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