培養細胞のグルコース取り込みを高感度に測定 Screen Quest™ グルコース取り込みアッセイ (比色 / 蛍光)

Screen Quest™ 比色グルコース取り込みアッセイは、培養細胞のグルコース取り込みを測定するための高感度で非放射性のアッセイです。

グルコース代謝は、主要なエネルギー源として多くの生物において重要なプロセスです。グルコースは、その大きいサイズによって細胞膜を越える単純な拡散が妨げられるため、細胞への輸送のために特定の膜貫通タンパク質の作用を必要とします。グルコースが細胞に入る比率は、インスリンなどのホルモンによって厳密に調節されており、それを代謝性疾患の有用なバイオマーカーにしています。例えば、インスリン刺激によるグルコース取り込みの欠如は2型糖尿病と関連しており、一方グルコースの取り込みの増加はがんに関連した高い解糖速度の徴候となっています。

原理

本アッセイは、グルコーストランスポーターによって取り込まれ、2-DG-6-リン酸(2-DG6P)に代謝されるグルコース類似体2−デオキシグルコース(2-DG)を利用します。2-DG6Pは代謝されないため、細胞内に蓄積し、蓄積された量はグルコース取り込みに比例します。 蓄積した2-DG6Pをさらに酸化してNADPHを得ます。生成されたNADPHのレベルは、細胞によるグルコース取り込みに比例したシグナルを生成するABD社のNADPHセンサーを使用して測定されます。蛍光アッセイも同様のアプローチを利用しています。
このアッセイでは、吸光マイクロプレートリーダー（A570 nm/A610 nmの比）または蛍光マイクロプレートリーダー（Ex / Em = 540 / 590 nm）を用いて、シグナルを検出します。

• Component A: 2-Deoxyglucose (2-DG, 10 mM )
• Component B: Glucose Uptake Buffer
• Component C: Acidic Lysis Buffer
• Component D: Neutralization Buffer
• Component E: Enzyme Probe
• Component F: Assay Buffer
• Component G: NADP
• Component H: 5× KRPH Buffer

1. 細胞を播種する。
2. 2-DGを加え、37℃で20-40分インキュベート
3. 細胞を洗浄し、溶解する。
4. アッセイ試薬を添加
5. 室温で30-120分インキュベート
6. OD比の増加を 570/610 nm で測定。蛍光の場合は540/590 nm で測定する。

図.1 分化した3T3-L1脂肪細胞および3T3-L1線維芽細胞における2DG取り込み測定
黒色クリアボトムプレート（Poly-Dリジンコート）にて細胞培養し、Screen Quest™比色グルコース取り込みアッセイキットを用いてアッセイを行った。
分析機器：SpectraMaxマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）
（A：ネガティブコントロール、インスリン無し、2DG処理無し。
B：インスリン非存在下での2DG取り込み。
C：1 µMインスリン存在下での2DG取り込み。
D：1 µMインスリンおよび200 µMフロレチンの存在下での2DG取り込み。
E：インスリン1 µMおよび5 mM Dグルコースの存在下での2DG取り込み。）
（詳しい操作についてはプロトコールをご参照ください。）

図.2 分化した3T3-L1脂肪細胞および3T3-L1線維芽細胞における2DG取り込み測定
黒色クリアボトムプレート（Poly-Dリジンコート）にて細胞培養し、Screen Quest™蛍光グルコース取り込みアッセイキットを用いてアッセイを行った。
分析機器：Geminiマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）
（A：ネガティブコントロール、インスリン無し、2DG処理無し。
B：インスリン非存在下での2DG取り込み。
C：1 µMインスリン存在下での2DG取り込み。
D：1 µMインスリンおよび200 µＭフロレチンの存在下での2DG取り込み。
E：インスリン1 µMおよび5 mM Dグルコースの存在下での2DG取り込み。）
（詳しい操作についてはプロトコールをご参照ください。）

※  表示価格について