商品情報

記事ID : 14619
研究用

融合タンパク質のタグの切断・除去にSelecTEV™ プロテアーゼ

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SelecTEV™ プロテアーゼは、Tobacco Etch Virus(TEV)のプロテアーゼを改良した 27kD のシステインプロテアーゼです。ネイティブのプロテアーゼと比較して、安定性・活性・特異性を向上させています。

本製品は、TEV 認識配列 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly を認識し、Gln と Gly の間で切断します。この7個のアミノ酸配列がタンパク質中に見つかることはまれであるため、SelecTEV™ プロテアーゼは、融合タンパク質のタグを除去するための理想的なツールであるといえます。切断に最適な温度は 30℃ ですが、広い温度範囲(4 – 30°C)および pH 領域(6.0 – 8.5)にわたって活性を有するため、様々なタンパク質に対応します。切断後は、SelecTEV™ プロテアーゼ N末端のポリヒスチジンタグを用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって容易に除去することができます。

本酵素は、E. coli からポリヒスチジンタグを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製されており、SDS-PAGE で検定した純度は 90% です。

SelecTEV プロテアーゼ™ は、TEV 認識配列を含む Expresso® Solubility and Expression Screening System vectors に使用することができます。

特長

  • 高い比活性と特異性
  • 安定性の高い設計
  • 6-His タグ付きで除去が容易

構成内容

  • SelecTEV™ プロテアーゼ (10 U/µL)
  • SelecTEV™ 20X バッファー
  • 100 mM DTT

使用例

SelecTEV™ プロテアーゼを使用して切断した融合タンパク質の SDS-PAGE 解析(CBB 染色)

SelecTEV™ プロテアーゼを使用して切断した融合タンパク質の SDS-PAGE 解析(CBB 染色)。本製品 10 U 、融合タンパク質基質 30 µg (トータル 100 µL)を、30℃で1時間インキュベートした。
マーカー(レーンM)、SelecTEV™ プロテアーゼ(レーン1)、切断されていない融合タンパク質(レーン2)、切断された基質と SelecTEV™ プロテアーゼ(レーン3)。

トラブルシューティング

問題点 考えられる原因 解決方法
タンパク質が切断されない SelecTEV™ プロテアーゼが切断部位にアクセスできない。 反応条件を変更してください。インキュベーション時間、温度、塩濃度、界面活性剤の量などを検討し、最適化してください。
反応条件の最適化についての詳細は、参考文献を参照してください。
TEV 切断部位と目的のタンパク質の間に、リンカーを加えてください。
サンプル中の成分による切断の阻害。 イミダゾールや界面活性剤などの阻害成分が含まれている。 切断の前に、透析などの方法を用いて、サンプルから阻害成分を除いてください。
IMAC 樹脂で捕捉(キャプチャー)できない SelecTEV™ プロテアーゼのアフィニティー樹脂への結合が、イミダゾールにより阻害されている 融合タンパク質を切断する間、透析によりバッファーからイミダゾールを除いてください。
樹脂の結合容量を超えている 樹脂の量を増やしてください。
融合タンパク質から切断された His タグ付き断片も、樹脂に結合することを考慮してください。
サンプル中の DTT や EDTA により、IMAC 樹脂から金属が失われた サンプルをカラムにロードする前に、DTT / EDTA を含まないバッファーで希釈または透析してください。
予想以上の切断産物が存在することから、非特異的な切断が考えられる 融合タンパク質中に、切断部位として認識されるモチーフが他にも存在する TEV プロテアーゼ認識部位となるアミノ酸配列が基質に存在するか調べてください。その部位を変異させる必要があります。
参考文献
  1. Kapust, R. B., Tözsér, J., Fox, J. D., Anderson, D. E., Cherry, S., Copeland, T. D., and Waugh, D. S. (2001). Tobacco etch virus protease: Mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Prot. Eng. 14: 993-1000.
  2. Kapust, R. B., Tözsér, J., Copeland, T. D., and Waugh, D. S. (2002a). The P1' specificity of tobacco etch virus protease. Biochem. Biophys. Res. Commun.294: 949-955.
  3. Lundbäck, A.K., Van Den Berg, S, Hebert, H, Berglund H., Eshaghi, S (2008). Exploring the activity of tobacco etch virus protease in detergent solutions. Analytical Biochemistry. 382: 69-71.
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  5. Phan, J., Zdanov, A., Evdokimov, A. G., Tropea, J. E., Peters, H. P. K., Kapust, R. B., Li, M., Wlodawer, A., and Waugh, D. S. (2002). Structural basis for the substrate specificity of tobacco etch virus protease. J. Biol. Chem. 277: 50564-50572.
  6. Tozser, J., Tropea, J. E., Cherry, S., Bagossi, P., Copeland, T. D., Wlodawer, A., and Waugh D. S. (2005). Comparison of the substrate specificity of two potyvirus proteases. FEBS J. 272: 514-523.
  7. Van den Berg, S., Lofdahl, P. A., Hard, T., and Berglund, H. (2006). Improved solubility of TEV protease by directed evolution. J. Biotechnol. 121: 291-298.

SelecTEV™ プロテアーゼ

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
SelecTEVTM Protease詳細データ LUC 30810-1 1000 UNIT
販売終了
SelecTEVTM Protease詳細データ LUC 30810-2 5000 UNIT
¥137,000

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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