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記事ID : 34696
研究用

SIRVs - Spike-In RNA Variant Controls

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RNA シーケンス解析(RNA-Seq)は様々な研究プロジェクトにおいて、非常に効果的なトランスクリプトーム解析ツールのひとつであり、近年では、臨床診断や治療への応用が期待されています。このようなアプリケーションでは、再現性・信頼性の高い結果を得て、適切な情報提供が求められます。マーカーやコントロールの使用は、データの信頼性を正確に判断するための重要な要素です。Lexogen 社のSpike-In RNA Variants(SIRVs)はRNA シーケンス解析の質およびコンパラビリティの評価に有用です。

特長

  • RNA シーケンス解析の質とコンパラビリティを評価するためのユニバーサルマーカーとして使用可能
  • RNA シーケンス解析のワークフローの評価、エラーの原因やバイアスの同定、ライブラリ作製からデータ解析までのワークフローの最適化にお勧め
  • 様々なシーケンスプラットフォームに対応
  • アイソフォーム解析に対応した幅広いデザイン(アイソフォームモジュール、ERCC モジュール)
  • 3 種類のセットをご用意
    (各種アイソフォームをミックスしたSIRV-Set 1 およびSIRV-Set 2、ERCC モジュールと組み合わせたSIRV-Set 3)

ワークフロー

Spike-In RNA Variant(SIRV)Control は、トランスクリプトームの複雑性を模した人工的な転写産物のセットで、試料(組織や細胞の溶解液、精製RNA)に添加し使用します。SIRVsは最終的なシーケンスリードのうち1-2% を占めます。SIRVsを使用することで、RNA シーケンス解析パイプラインや、サンプル調製毎の手技的ノイズを評価するための正確性や精度といった値が得られます(図1、Evaluation)。実験間での整合性はこれらの値や変動係数(CoD)によって算出されます(図1、Comparison)。

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図.1 RNAシーケンス解析におけるSpike-In RNA Variant(SIRV)Control の利用
Spike-In RNA Variants(SIRVs)を試料に少量添加し、ライブラリ作製を行う。用いた試料のゲノムとSIRV にリードをマッピングした後、SIRV コントロールのデータを基準として、解析データを評価する。RNA-Seqワークフローの評価により、バイアスや盲点が明らかになります。また、このコントロールのデータは、作製 したライブラリが様々な解析に使用可能な精度か否かの判断基準となります。

 

デザイン

  • モジュールのデザイン
    RNA spike-in control はアイソフォームモジュール、ERCCモジュールが利用可能です。
  • アイソフォームモジュール
    SIRV アイソフォームモジュールは、ヒトの7 つのモデル遺伝子に由来する69 種類の転写バリアントから成り、トランスクリプトームの複雑性を模しています(図2)。このモジュールは選択的スプライシング、選択的な転写開始/ 転写終結、重複遺伝子、アンチセンス転写産物等を反映しています。6 種類または18 種類の転写バリアントを用いることで十分なアイソフォームの複雑性を生み出し、厳密なRNA シーケンスワークフローを可能にします。1 また、SIRV アイソフォームは、異なるシーケンサーや解析パイプラインを用いて作成したデータの整合性の評価にも利用されています。2 SIRV アイソフォームはSIRV転写産物が等モルで混合されているMix E0、異なるモル比率で混合されているMix E1(〜8 倍)、Mix E2(〜 128 倍)で構成されています。
  • ERCC モジュール
    ERCC モジュールは、外部RNA 標準コンソーシアム(ERCC)により開発された重複の無い92 種類の人工的な転写産物です。ユニークな配列特性から、ERCC コントロールはアイソフォームに関わりなく各種パラメーターの評価に最適です。ERCC Mix 1 は220(106)のダイナミックレンジをカバーしており、幅広い転写産物濃度に対応しています。3、4 濃度既知のリードを比較することでダイナミックレンジ、用量反応、検出限界、ワークフローの効率を評価することが可能です。
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図.2 SIRVs のデザイン
SIRV1 からSIRV7 はヒトモデル遺伝子を模倣しており、主要な選択的スプライシングや転写を表している。(A)7 種類のSIRV アイソフォーム遺伝子と92 種類のERCC 遺伝子を人工的な染色体“SIRVome”として示す。(B)SIRV3 を拡大し、11種類の転写バリアントを緑色で示す。灰色で示した転写バリアントは他の評価法のための追加アノテーションである。(C)SIRVミックス中の既知のアイソフォーム濃度より、得られたリードカバレッジ(緑色の領域)の情報と併せて、予想される遺伝子とエクソンジャンクションのカバレッジを比較することができる(青線はプラス鎖、赤線はマイナス鎖を示す)。

 

データ解析

スパイクインRNA シーケンス実験のデータは、リードがゲノムDNA のリファレンス配列やSIRVome にマッピングされる段階まで一様に処理されます。バイオインフォマティックツールは、リードマッピング(いわゆる生データ)から転写産物を同定、定量するまでの各段階において、検出されたリード分布と予想リード分布を比較するものです。

データ解析ワークフローとして、無料で利用可能なSIRV Suite がおすすめです。SIRV Suite はデータ解析プラットフォームGalaxyのツールやアルゴリズムを利用しており、実験間の比較を行うだけでなく、SIRV 実験のデザインや評価が可能です。ERCC リードの評価には、NIST が提供している“ERCC dashboard”5 と呼ばれるソフトウェアパッケージやSEQC/MAQC-III コンソーシアムが紹介している評価法6 が利用可能です。

算出されたクオリティ値は、正確性や精度、測定されたカバレッジと予想カバレッジ間の変動係数(Coeffi cient of Deviation;CoD)を含みます(図2)。データ比較において、決定的なパラメーターはバイアスの程度よりもバイアスの一貫性であり、実験間の差は一貫して蓄積されたSIRVs を基に同定されます。このように、データセットが比較可能かは情報に基づき判断ができ、実験固有の変動に対してベースラインを設定することが可能です。

 

SIRV セット

3 種類のSIRV セットをご用意しています。

表.1 SIRVセットのセレクションガイド
SIRVセット1(品番:025.03)はIsoform Mixes E0、E1、E2を含みます。SIRVセット2(品番:050.01、050.03)は Mix E0のみ含みます。SIRVセット3(品番:051.01、051.03)は Mix E0と ERCCの混合物です。
✓:適用あり、-:適用なし
SIRV-Set 1 SIRV-Set 2 SIRV-Set 3
Cat. No.
025.03
050.01 / 050.03
051.01 / 051.03
Modules Isoform
Mixes E0, E1, E2
Mix E0
Mix E0
ERCC
-
-
Mix 1
Property Isoform detection and quantifi cation
Dynamic range
partially applicable
-
Applications Pipeline validation
partially applicable
partially applicable
Sample control
-
Format Storage
-20 °C
dried, storage at room temperature

SIRVセット 1

SIRVセット 1はアイソフォームモジュールの混合物を 3種類含みます(E0、E1、E2)。また、各混合物は 7つの SIRV遺伝子に由来する 69種類の SIRVアイソフォーム転写産物 から構成され、異なる比率で混合されています(図3)。E0は、69種類の転写産物が等モルで混合されており、これらの検出はリード深度と相関しないため、検出能の検証に最適です。E1は緩やかな濃度分布でバリアントを含みますが、E2はより自然に近いかたちを表現しているため、ドミナントなバリアントや量が豊富なバリアントが他の低い発現レベル (<1%)のバリアントともに転写されます。このような自然に近い濃度分布は、短いリードアセンブリを基にした転写産物の定量にはあまり向きませんが、リード深度に制限があるロングリードシーケンス解析においては直線性や感度を評価することが可能です。

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図.3 3種類のアイソフォームミックス中の 4つのサブミックスの分布とその比率
各SIRV セットはサブミックスの混合品として提供される。7 種類のSIRV 遺伝子由来のアイソフォームはすべてのサブミックスにまたがり分布している。(左)intra-mixの濃度比率は3 種類の異なる濃度で設定されており、相対的な濃度評価を正確に行うことが可能である。(右)予め調整されたサブミックスの濃度比率により、3 つのinter-mixの比較を差次的遺伝子発現の評価に利用することができる。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
SIRV-Set 1 (Iso Mix E0, E1, E2)詳細データ LEX 025.03 3 RXN
お問い合わせ

SIRV セット2

各SIRV アイソフォームが等モル濃度で含まれるアイソフォームモジュールE0 の凍結乾燥品です。RNA-Seq においてリード深度より、転写量の異なる多様な転写産物の検出を重視する際にお勧めです。また、実験のフィンガープリントはインプット濃度ではなく単にSIRV アイソフォームの複雑性に依存するため、SIRV セット2 はデータの整合性の評価に最適です。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
SIRV-Set 2 (Iso Mix E0)詳細データ LEX 050.01 1 VIAL
¥114,000
SIRV-Set 2 (Iso Mix E0)詳細データ LEX 050.03 3 VIAL
¥325,000

SIRV セット3

SIRV セット3 は、アイソフォームミックスE0 およびERCCミックスを等量含みます。69 種類のSIRV アイソフォーム転写産物と92 種類のオーバーラップのないERCC RNA を含むことにより、高度な複雑性を有し、幅広い濃度レンジをカバーします。また、手技的な詳細情報を得ることにより個々の試料や実験を比較するフィンガープリントを引き出すことができ、RNA シーケンスのワークフロー全体において、より包括的な品質評価とモニタリングが可能です。各ERCCアイソフォームは210(106)の濃度幅をカバーし、さらに等モルのSIRV アイソフォームを加える事で補完しています(図4)。

SIRV セット3 に含まれる転写産物の濃度および複雑性

図.4 SIRV セット3 に含まれる転写産物の濃度および複雑性
遺伝子あたり最大18 転写産物を含むアイソフォームモジュールは、これらに対するRNA を等モル濃度含む。シングルERCC アイソフォームは210(106)の濃度幅をカバーし(灰色)、自然に存在する転写産物のダイナミックレンジに相当する。アトモル(attomoles)はスパイクインした100 ng total RNA の量を表す。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
SIRV-Set 3 (Iso Mix E0/ERCC)詳細データ LEX 051.01 1 VIAL
¥126,000
SIRV-Set 3 (Iso Mix E0/ERCC)詳細データ LEX 051.03 3 VIAL
¥251,000

【関連情報】

参考文献

  1. Paul, L., et al. (2016) SIRVs: Spike-In RNA Variants as External Isoform Controls in RNA-Sequencing. bioRxiv. DOI:10.1101/080747
  2. Weirather, J. L., et al. (2017) Comprehensive comparison of Pacific Biosciences and Oxford Nanopore Technologies and their applications to transcriptome analysis. F1000Res 6, 100. DOI: 10.12688/f1000research.10571.1
  3. Baker, S. C., et al. (2005) The External RNA Controls Consortium: a progress report. Nature Methods 2, 731-734. DOI:10.1038/nmeth1005-731
  4. The External RNA Controls Consortium. (2005) Proposed methods for testing and selecting the ERCC external RNA controls. BMC Genomics 6, 150. DOI:10.1186/1471-2164-6-150
  5. Munro, S. A., et al. (2014) Assessing technical performance in differential gene expression experiments with external spike-in RNA control ratio mixtures. Nature Communications 5, 5125. DOI:10.1038/ncomms6125
  6. SEQC/MAQC-III Consortium. (2014) A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology 32, 903-914. DOI:10.1038/nbt.2957

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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