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記事ID : 33048
研究用

メチル化ヒストンのChIPアッセイ用に開発されたspike-inSNAP-ChIP K-MetStat Panel

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SNAP-ChIP(Sample Normalization & Antibody Profiling for ChIP)のK-MetStat™パネルは、H3およびH4ヒストンのメチル化リジンに対するChIPアッセイのspike-inとして、抗メチル化リジン抗体の特異性の検証やエフェクタータンパク質の結合試験に適しています。

背景

K-MetStat Panel

SNAP-ChIPは、qPCRや次世代シーケンサーにより解読できる147bpのバーコードDNAに包まれた、E.coli由来の組み換えヒトヌクレオソーム(dNuc)を使用しており、クロマチン免疫沈降(ChIP)用に次世代のspike-inとして開発されました。

SNAP-ChIPのK-MetStat™(lysine-methylation status)パネルは、疾患に関連するH3およびH4ヒストンのリジン残基がメチル化された、16種類のdNucにより構成されています(右図参照、未修飾1(me0)+メチル化修飾15:修飾サイト5種(H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H4K20)とメチル化の状態3種(me1, me2, me3))。

EpiCypher社のK-MetStat™ パネルは、従来のプロトコールを変更することなく様々なChIPアッセイに容易に加えることができる上に、抗体特異性の厳密なバリデーション(製品データ参照)や手技的なバラツキのモニタリングを可能とします。

使用目的

  • IP抗体の特異性およびプルダウン効率の特定
  • サンプル間/実験間における手技的なバラツキをモニタリングし標準化
  • DNAバーコードを定量PCRで測定することにより次世代シーケンスを行うべきか判断可能
  • ホモジニアスに調製されたdNucによるlot-to-lotの厳密なコントロール
SNAP-ChIP K-MetStat Panel

図1. SNAP-ChIPの概要
バーコードDNAによる識別可能な翻訳後修飾(PTM : post-translational modifications)をともなうdNucを、特異的抗体によるIP前にサンプルクロマチンに加えます。IP後、dNucのオンターゲット・オフターゲットの回収率をバーコードDNAで測定します。

詳細なプロトコールは、以下のマニュアルをご参照ください。

構成内容

SNAP-ChIP K-MetStatパネルには、ChIP実験10回分の試薬が含まれています。

  • 組み換えモノヌクレオソーム16種類ミックス
    (10 mM カコジル酸ナトリウム、pH 7.5, 100 mM NaCl、1 mM EDTA、50%グリセロール (w/v)、1× プロテアーゼ阻害剤カクテル、100 µg/mL BSA、10 mM β-メルカプトエタノール)
    Molarity = 0.6 nM. MW = ~199382.1 Da (average MW of all 16 nucleosomes).

その他必要な試薬・機器

  • ChIP用試薬
  • TaqMan® or SYBR® green用試薬
    *感度の良いTaqMan® qPCRを推奨しますが、SYBR® green qPCRでも可能です。
  • SNAP-ChIPプライマー(Forward/Reverse)
  • qPCRプレート
  • qPCR機

製品データ

SNAP-ChIPによる抗体特異性の評価

図2. SNAP-ChIPによる抗体特異性の評価
SNAP-ChIP試験(n=3)により、2種類の市販の抗H3K4me3抗体(#1および#2)の特性を評価した。抗体#1のH3K4のメチル化状態の変化に対する交差性は3%以下であったが、抗体#2はH3K4me2に対して60%程度の交差性を示しており、抗体#2を用いたChIPでは非特異性による実験結果への影響が示唆された。

参考文献

  1. Grzybowski AT et al., Calibrating ChIP-Seq with Nucleosomal Internal Standards to Measure Histone Modification Density Genome Wide. Mol Cell. 2015 Jun 4;58(5):886-99. PMID: 26004229

SNAP-ChIP K-MetStat Panel

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
SNAP-CHIP K-METSTAT PANEL詳細データ ECY 19-1001 20 UL
¥95,000

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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