新型コロナウイルス検出キット
SUDx-SARS-CoV-2検出キット

本製品は、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）検出のためのリアルタイム1-step RT-qPCRキットです。

糖鎖固定化金ナノ粒子を用い、磁性分離を行うため、1検体から３分間ほどでウイルスRNAの濃縮・精製ができます。また、検体採取時の暴露リスクの少ない唾液検体での検出ができます。検出のためのプライマーとプローブは、アメリカ疾病予防管理センター（CDC）の「2019-Novel Coronavirus（2019-nCoV）Real-time rRT-PCR Panel Primers and Probes」(Effective:24 Jan 2020)に記載された2019-nCoV_N1 セットを改変^※1したもの（mCDC セット）および、国立感染症研究所の「病原体検出マニュアル 2019-nCoV Ver2.9.1」に記載されている、N2 セットを改変^※1したもの（mNIID セット）を採用しています。

※1 本製品のプライマー、プローブセットにつきましては、鹿児島大学 隅田泰生教授に監修いただきました。

• ウイルス RNA の濃縮・精製（PCR 反応の前処理）は３分間（1 検体あたり）で完了できます。
• 唾液検体を 300〜600 µL（Boom 法^※2と比較し約 2〜4 倍）利用し、さらに 25〜50 倍（Boom法は約2 倍）に濃縮できるため、ウイルス濃度の低い唾液検体を用いた測定が可能です。
• 蛍光プローブを用いてプライマーの配列を検討した結果、より高い特異性と高感度を達成しています。１反応あたり 10 コピーのウイルスが検出できます。

※2 国立感染症研究所の「病原体検出マニュアル 2019-nCoV Ver2.9.1」に記載されてい る QIAamp Viral RNA Mini キットによる RNA の抽出法
[R. Boom, et al., Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids, J. Clin. Microbiol., 28(3), 495-503 (1990)]

本製品は以下のように、キットⅠ とキットⅡ で構成されており、検体の前処理からRNAの検出までを行うことができます。本キット以外に以下の機器と器具が必要です。

• リアルタイム PCR 測定機
• 専用反応チューブあるいはプレート
• マイクロピペットおよびチップ
• 卓上ミニ遠心分離機

キットⅠ（前処理用キット）▼

キットⅠ（前処理用キット）

キット Ⅰ（5 検体分に小分けしたものが 10 セット）には、以下の①−1 が 50 本、①−2 が 50 本、 ②〜④−4 が密封されているアルミ小袋が 50 個、⑤が 10 個入っています。
①−1 スポイト（1 mL）検体採取用
①−2 スポイト（1 mL）反応溶液混合用
② サンプル希釈用バッファー（DTT と PS 含 PBS 0.5 mL）入りプラスチックチューブ （透明シール蓋）1 本
③ サンプルチューブの蓋 1 個
④−1 糖鎖固定化ナノ粒子（DS-SMGNP）入りプラスチックチューブ（透明シール蓋）1 本
④−2 磁性マイクロ粒子入りプラスチックチューブ（透明シール蓋）1 本
④−3 洗浄用バッファー（PS 含 PBS）入りプラスチックチューブ（透明シール蓋）1本
④−4 ウイルス溶解用バッファー（SDS 入り RNase free water）入りプラスチックチューブ（透明シール蓋）1 本
⑤ 分離用磁石

キットⅡ（RT-PCR 試薬と、PCR プライマーおよびプローブ）▼

キットⅡ(RT-PCR 試薬と、PCR プライマーおよびプローブ)

2−1）RT-PCR 試薬
プローブ検出法（5´-ヌクレアーゼ法）によるリアルタイムRT-PCR専用の試薬を使用します。
RT-PCR を 1 チューブ内で連続的に行えるため、操作が簡便でコンタミネーションの心配がありません。また、増幅産物をリアルタイムで検出でき、PCR後に電気泳動などで確認する必要がありません。

内容（100 回分（50 検体分）；16 µL 反応系）
※ スピンダウンしてから、チューブのふたを開け、ピペッティングにより撹拌してください。使用後は速やかに-20℃で保存してください。

• 1. 反応液 1280 µL ｘ1 本 (注１)
• 2. 酵素液 66 µL ｘ1 本 （注２）

注 1： dNTP 混合物と Mg^2＋を含む。 注 2： RNA 分解酵素の阻害剤を含む。

2−2）PCR プライマー・プローブセット
※ スピンダウンしてから、チューブのふたを開け、ピペッティングにより撹拌してください。使用後は速やかに-20℃で保存してください。

2−2A）mCDC セット 95 µL（チューブ 1 本）
Forward primer: 5´-GACCCCAAAATCAGCGAAATG-3´
Reverse primer: 5´-ATGTTGAGTGAGAGCGGTG-3´
Probe（mCDC） : FAM-5´-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-3´-MGB

2−2B）mNIID セット 95 µL（チューブ 1 本）
Forward primer: 5´-ATTTTGGGGACCAGGAACTAATC-3´
Reverse primer: 5´-CGTTCCCGAAGGTGTGACTT-3´
Probe（mNIID）: FAM-5´-ATGTCGCGCATTGGCATGG-3´-MGB


3) 陽性コントロール
※ スピンダウンしてから、チューブのふたを開け、ピペッティングにより撹拌してください。使用後は速やかに-20℃で保存してください。

2-2A）および 2-2B）のプライマーで PCR 反応を行った際に増幅できる塩基配列を含む DNA 2 種類の混合物 100,000 コピー/µL （20µL 入りチューブ 1 本）

• キットⅠ：常温（4〜35℃）保存
• キットⅡ：冷凍（-20℃）保存

（1）前処理（キットⅠを使用します）▼
1. ①−1 のスポイトを使用し、検体（唾液または鼻咽頭スワブ液）を約 0.3〜0.6 mL採取します。
2. バッファー入りの②のシールをはがし、唾液検体の全量を②に入れ、そのまま①−1 のスポイトで混合し、サンプルチューブの蓋③をつけ、1500 rpm 以上で約 10 秒間遠心分離し、不溶物を沈殿させます。（一般には簡易型の遠心機（チビタン）を使用します。）
3. ①−2 のスポイトを用いて沈殿物をすわないように上澄みを 0.5mL とり、糖鎖固定化ナノ粒子入りの④−1 のシールをはがして④−1へ加え、数回出し入れして溶液を混合します。そして、全量を吸い取り、磁性マイクロ粒子入りの④−2 のシールをはがして④ −2 に入れます。
4. 同じスポイトで混合します（黒色の磁性マイクロ粒子がよく混ざるように、5 回ほどそっと出し入れします。）
5. ④-2 のチューブの外から磁石をあて、磁気分離します（キット付属の磁石を用いてもよいです）。約 10 秒後、スポイトで上澄みを吸い取り、④−1 のチューブにいれチューブごと廃棄します。
6. 残った黒色の粒子に、バッファー入りの④−3 のシールをはがし、④−3 の溶液を同じスポイトで全量を吸い取って加え、そのまま同じスポイトで混合します（黒色の粒子がよく混ざるように 5 回ほどそっと出し入れします）。
7. ④−2 のチューブの外から磁石をあて、磁気分離します（キット付属の磁石を用いてもよいです）。約 10 秒後、スポイトで上澄みを吸い取り④−3 のチューブにいれチューブごと廃棄します。この際、できるだけ上澄みを捨てるようにしてください。
8. ④−2 の残った黒色の粒子に、バッファー入りの④−4 のシールをはがして④−4 の溶液を全量（20 µL）加え、混合します（黒色の粒子がよく混ざるように軽くタッピングするか、ピペッティングします）。④−2 のチューブの外から磁石（キットの付属品を用いてもよい）をあて、上澄みを 1 µL ずつとり、それらを以下のように RT-PCR 反応溶液に入れて RT-PCR を行います。

（2）RT-PCR 反応液の調製（氷上で調製してください）▼

使用する PCR 測定機が、ウェル間の蛍光シグナルの補正を行う必要が無い場合の反応溶液の調製法です。1 反応液の総量は 16µL を推奨します。補正を行う必要がある機器を使用される場合は、別途試薬を購入してください。

試薬	使用量	最終濃度
反応液	12.7 µL
酵素液	0.6 µL
mCDCセット、またはmNIIDセット	1.7 µL	プライマー濃度は0.27 µM プローブ濃度は0.52 µM
検体液（前処理（8）の液体）	1 µL

（3）RT-PCR サイクル条件▼

下記の温度サイクルで反応します。 Thermal Cycler Dice Real Time System Ⅱ または Ⅲ を使用するときの推奨条件です。（ウェル間の蛍光シグナルの補正を行う必要のない機器のため、内部標準は必要ありません）

逆転写反応	42℃ 5 分
プレ変性	95℃ 10 秒
変性 会合・伸長	95℃ 5 秒 60℃ 30 秒 ×45 サイクル

PCR 測定にはタカラバイオ社の Thermal Cycler Dice Real Time System Ⅱ または Ⅲ を使用し、付属のソフトで Ct 値は自動測定されています。

※1 陽性コントロールで Ct≦41 の立ち上がりが認められない場合や陰性コントロールで立ち上がりが認められる場合は、再測定してください。

※2 Ct 値 41〜45 で立ち上がりが見られた場合は ± とし、mCDC セット、mNIID セット共に ± または、どちらか一方が ± でどちらか一方が検出されない場合は、反応溶液を２倍（32 µL）にして再測定してください。なお、再測定しても同様の結果になった場合は、陽性の可能性がありますので、検体を採取し直し、再度測定してください。

陽性コントロールの検出例

ｍCDC セットまたはｍNIID セットが増幅できる遺伝子配列の DNA を 100,000、10,000、1,000、100、10 コピー/µL に希釈し、それを反応液に 1 µL 加え、前述のプロトコールで RT-PCR を測定し、Ct 値を測定し、下に示すようにそれぞれキャリブレーションカーブを作製しました。
陰性コントロール（RNase Free 水）では、いずれも Ct 値は観測されていません。なお、PCR 測定にはタカラバイオ社の Thermal Cycler Dice Real Time System Ⅱ または Ⅲを使用し、付属のソフトで Ct 値は自動測定されています。なお、ウェル間の補正が必要ない機器のため、内部標準は使用しません。

以下のように、上記 PCR 測定機を用いた場合、1 時間以内に逆転写および遺伝子増幅が達成され、検出限界は数コピー/µL でした。従って、国立感染症研究所の性能評価マニュアルにある 3 つのカテゴリーのうち「15 分〜1 時間未満、検出限界 100 ウイルスゲノムコピー/反応以下」にあたります。

図1 ｍCDC セットの例

図2 ｍNIID セットの例

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