細胞の遊走、接着、ローリングがリアルタイム観察可能 SynRAM 3D 炎症モデルスターターキット

SynVivo社のSynRAM™ 3D Inflammation Modelは、現実的で動的な環境において炎症経路全体を研究するために開発してきました。SynVivoプラットフォームは、組織や腫瘍細胞を内皮細胞管腔と共培養させて組織学的切片を再構築することで、流速や剪断をはじめ生理学的に本物そっくりなモデルであり、回転、接着、および遊走過程をリアルタイムで追跡できます。このモデルは、in vivo研究に対して良好に検証されており、転がり速度、接着様式、および遊走過程において優れた相関性が得られています (Lamberti et al 2014, Soroush et al 2016)。

• 微小血管環境内での生理学的剪断ストレス
• 管腔が完全に囲まれたin vivo様血管形態
• 細胞間相互作用のために共培養が可能
• 一回の実験で、回転、接着、および遊走データをリアルタイムで定量的に取得

図.1 SynRAMは、回転、接着、および遊走といった細胞の相互作用を複数の細胞層を介して1回の実験においてリアルタイムで評価でき、そのデータはin vivo結果と非常によい相関性を示します。

SynRAMのデザインは画期的で、フローチャンバーやTraswellチャンバー型アッセイに潜む現行の限界を克服できます。現行のフローチャンバーデザインは単純化されすぎており、微小環境の尺度や形状に欠け、移動をモデル化できません。同様に、Transwellチャンバーはin vivoでみられる流体剪断や大きさ/トポロジーが考慮されておらず、遊走のエンドポイント測定は再現性が悪く、リアルタイムでの画像も得られません。

SynVivo社独自のチップデザインは、複雑なin vivo由来の微小血管ネットワーク（デジタル化画像より入手）から、本物そっくりな細胞構造や血管形態を産生して各種の剪断や流動条件が得られ細胞構造や定常的な剪断や流動条件を再現できるよう単純化された理想的なネットワークに至るまで多岐にわたります。

SynRAMモデルを用いてアッセイを行う際に基本的に必要なものはキットとしてご購入頂くこともできます。個々の実験目的に応じて、SynRAM チップは“理想化” または “微小血管”配置からお選びください。チューブ、クランプ、針、およびシリンジといった全てのアクセサリーが添付されています。スターターキットには気圧式プライミング装置（SynRAMを用いてアッセイを行う際に必要）も含まれています。

SynRAMはin vivoデータに対して良好に検証できた

SynRAM微小流体チップは本物そっくりな微小血管ネットワークで形成されており、白血球接着カスケードの各段階に対する古典的な阻害剤の役割を理解するために使用しました。実験結果はin vivoデータと非常によく一致し、形態学的に本物そっくりな環境におけるこれらの動態現象のリアルタイム分析への本プラットフォームの独特な能力が強調されました(Lamberti et al 2014)。

図.4 SynRAM微小流体チップを用いた好中球回転はin vivoにおける白血球回転と類似していた。
in vivoとSynRAMチップで測定した白血球転がり速度の比較を箱ひげプロットにより示した。顕著な違いは見られなかった（p=0.758; Mann-Whitney Rank Sum Test）。箱内の"+" マークは平均値を示す。

図.5 SynRAM微小流体チップにおける好中球接着はin vivoにおける白血球接着に類似していた。
マウス精巣挙筋のin vivoモデルと微小流動チップにおけるin vitroモデルにおいて、それぞれ接着白血球と好中球分布を近隣の二分枝からの距離関数として示した。いずれのヒストグラムも左側に歪んでおり、白血球と好中球が何れも分枝近隣に優先的に接着することが示唆された。また、ピークは近隣の分枝から¹血管またはチャネル直径離れたところで生じた。

モノクローナル抗体を用いた炎症経路の特定段階遮断による効果を研究

接着/遊走カスケードの特定段階を抗体で遮断することにより、当カスケードの他の段階が下方制御されました。E-セレクチン（αE-セレクチン）、ICAM-1（αICAM-1）、およびPI3K（ワートマニン）に対するモノクローナル抗体は、SynRAM微小流動装置において回転、接着、および遊走する好中球数を著しく低減しました。

図.6 それぞれの抗体遮断剤で細胞を処理後、そのコントロール群と比較した活性率を示した。

敗血症関連炎症応答におけるタンパク質キナーゼCδ（PKCδ）の機序解明

SynRAMモデルを用いて、炎症応答において顕著な役割を担うことが示されているタンパク質キナーゼCδ（PKCδ）依存性好中球-血管内皮相互作用の根底にある機序を同定しました。生理的流体流動条件において、回転、接着、遊走からなる炎症工程の全てをリアルタイムで観察したところ、PKCδが炎症時にヒト内皮細胞を介したヒト好中球接着および遊走において非常に重要な制御因子であることが示唆されました。

図.7
PKCδ-TAT 阻害剤は、未処理コントロールに比べて、fMLP介在性シグナル伝達に応答して好中球が血管チャネルから炎症した内皮細胞（TNF-αで4または24時間処理）を横切って組織コンパートメントへと遊走するのを著しく低減させた。

図.8
手術から24時間後の代表的な肺組織切片におけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）の免疫組織化学検出。シャム手術ではMPO陽性細胞がほとんど見られなかった。敗血症は肺実質全体へ多数のMPO陽性細胞の浸潤を誘導した。PKCδ-TAT阻害剤は、肺における敗血症誘導性、MPO陽性細胞数を著しく低減させたことから、好中球遊走の低減が示唆される。

The SynRAM 3D Inflammation Modelは、様々な細胞遊走アッセイに使用可能

• 走化性と遊走
  細胞を血管チャネルで培養し、走化性因子を組織チャンバーまたは2次血管チャネル（理想化ネットワークを利用した場合）に注入しました。免疫細胞の構築した多孔性チャネルから組織チャンバーへのリアルタイムでの遊走が確認できました。本アッセイは静止状態または流動状態の何れでも実施できました。
• 血管(内皮細胞) 介在性回転、接着、および遊走アッセイ
  血管チャネルで培養された内皮細胞を生化学的または化学的薬剤で活性化させて炎症性応答を産生させた後、免疫細胞の内皮を介した組織チャンバーへの回転、接着、遊走をリアルタイムで追跡しました。
• 血管および組織共細胞介在性の回転、接着および遊走アッセイ
  内皮細胞を血管チャネルで培養し、組織チャンバーには平滑筋細胞、上皮細胞、線維芽細胞または組織特異的細胞（例えばアストロサイトや肝細胞）を収容しました。細胞シグナル伝達や炎症活性化に応答した、内皮細胞を介した回転、接着および遊走をリアルタイムで観察し定量できます。

図.9 WBCsの炎症性血管組織海面を介した回転、接着および遊走

※注：細胞、培地、およびマトリックスといった上記以外の必要な消耗品はキットに含まれません。研究室機器として、培養器、倒立顕微鏡、およびシリンジポンプが必要です。

※注：細胞、培地、およびマトリックスといった上記以外の必要な消耗品はキットに含まれません。研究室機器として、培養器、倒立顕微鏡、およびシリンジポンプが必要です。

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