商品情報

MarkerGene™ 社のTMRM アッセイキットは生細胞のミトコンドリア膜電位変化を定量するキットです。ミトコンドリアに局在する赤い蛍光プローブtetramethylrhodamine, methyl ester(TMRM)を使用し、ミトコンドリア膜の脱分極を検出します。

背景

ミトコンドリア膜電位(Δψm)はミトコンドリアの状態と非常に強く関係しています。そのため、ミトコンドリア膜電位の可視化は、ミトコンドリアの機能をモニターするために広く使用されています。ΔψmはATP合成、ROS産生、ミトコンドリアカルシウムストア、ミトコンドリアへのタンパク質輸送を制御しています。逆に、ΔψmはATP、ミトコンドリアのプロトンコンダクタンス、電子伝達系、ミトコンドリアカルシウムによって制御されています。Δψmの薬理学的変化は、パーキンソン病や多発性硬化症、その他の神経疾患に関与しているミトコンドリアの病理学的パラメーターと関連しています。

負に分極したミトコンドリアに蓄積されると、TMRMは蛍光を発します。アポトーシス細胞や代謝ストレス細胞でミトコンドリアの膜電位が崩壊すると、TMRMはサイトゾルから流出し、蛍光レベルが劇的に低下します。

特長

  • ポジティブコントロール(FCCP)、イメージング用バッファー添付で初心者にも使いやすい
  • フローサイトメトリー、蛍光プレートリーダー、蛍光顕微鏡に対応
  • 単一波長(Ex/Em=548/573)で測定可能

構成内容

  • TMRM Reagent (1mM) in DMSO:100μL
  • FCCP (50mM) in DMSO:25μL
  • Opti-Klear™ Live Cell Imaging Buffer (5x) : 30mL

製品使用例

ヒト線維芽細胞

図1:ヒト線維芽細胞を200nM TMRMで染色した。

プロトコール

顕微鏡用プロトコール概略

  • 薬剤効果を調べる場合は、本キット使用前に細胞を薬剤処理してください。
    *ポジティブコントロールを使用する場合には、TMRM染色10分前に無血清培地中の細胞に20μM FCCPを添加してください。
  • 無血清培地でTMRM Reagentを20nM-1000nMに希釈し、ワーキング溶液を用意します。
  • 細胞から増殖培地を吸引除去します。
  • PBS(キットに含まれない)で細胞を洗浄し、PBSを吸引除去します。
  • ステップ2で用意したワーキング溶液に細胞を浸します。
  • 37℃ 暗所で15-45分インキュベートします。
  • 染色溶液を吸引除去します。
  • Opti-Klear™ Live Cell Imaging Buffer (5x) を滅菌水で1xにします。
  • ステップ8で用意したOpti-Klear™ Live Cell Imaging Buffer(1x)に細胞を浸します。
  • EX/EM=548/573を観察できるフィルターの蛍光顕微鏡システムで細胞を観察します。

マイクロプレートアッセイプロトコール(浮遊細胞)概略

  • 105-2x105 cells/well(100-200 μL培地/well)になるように細胞を用意します。
  • 培地でTMRM Reagentを希釈し、10-20xワーキング溶液を調整します。
    これを最終濃度が1xになるように細胞に加えます。
  • インキュベーターに戻し、15-45分間インキュベートします。
  • 細胞を遠心し、培地を吸引除去します。
  • 細胞をPBS/0.2% BSAに再懸濁し、再度遠心して細胞をペレットにします。
  • Opti-Klear™ Live Cell Imaging Buffer (1x) に細胞を再懸濁し、細胞をマイクロプレートに播種します。
  • TMRM色素の波長(EX/EM=548/573)に適した設定の蛍光プレートリーダーで測定します。

マイクロプレートアッセイプロトコール(接着細胞)概略

  • 測定時に70%コンフルエントになるように細胞をマイクロプレートに播種します。
  • プレートから培養培地を除去します。
  • TMRM入りの無血清培地を細胞に添加します。
  • インキュベーターに戻し、15-45分間インキュベートします。
  • 培地を吸引除去し、PBS/0.2% BSAで洗浄します。
  • Opti-Klear™ Live Cell Imaging Buffer (1x) に細胞を浸します。
  • TMRM色素の波長(EX/EM=548/573)に適した設定の蛍光プレートリーダーで測定します。

フローサイトメトリーアッセイプロトコール概略

  • 解析には105 cellsを用いるのが最適です。浮遊細胞では106 cells/mL未満、接着細胞では70%コンフルエント未満をアッセイに使用してください。
  • TMRM Reagentを培地中の細胞に添加し、15-30分インキュベートします。
  • フローサイトメトリーでは培地を除去する必要はありません。
    *培地の代わりにOpti-Klear™ Live Cell Imaging Bufferを使用した場合、バックグラウンドが高くなります。
  • 解析前に細胞塊がなくシングルセルになっていることを確認してください。
  • 488nmで励起し、ピーク蛍光波長575nmに適したフィルターチャネルで検出します。
表1:ワーキング溶液の推奨濃度
アプリケーション 濃度(nM)
96ウェルマイクロプレートアッセイ 200-1000
フローサイトメトリー 50-400
顕微鏡 50-200

TMRM アッセイキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
MarkerGeneTM TMRM Assay Kit詳細データ MGT M1690 1 KIT
¥85,000

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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