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研究用

20分で高速・高収量に分離可能!脂肪組織&脂肪細胞トータルタンパク質抽出キット

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培養脂肪細胞や白色脂肪組織(WAT)/褐色脂肪組織(BAT)から、トータルタンパク質を20分以内に迅速、高収量で抽出できるキットです。

抽出したタンパク質は、二次元電気泳動解析、ELISA、SDS-PAGE、イムノブロット、免疫沈降、酵素活性アッセイ、その他のアプリケーションにご使用いただけます。

101 Bio社 高速・簡便なタンパク質抽出キット

使用目的

脂肪組織は、エネルギー貯蔵機能に加え、内分泌や炎症に関連する重要な器官として認識されています。そのため、脂肪組織中のタンパク質の分離・解析は、生理学的または病理学的状態の解明に必要とされています。

しかしながら、脂質含有量が高く、タンパク質含有量の低い脂肪組織(WAT/BAT)からタンパク質を分離して解析する方法は、技術的に困難です。また、生物学的サンプル中の水−油エマルジョンの分離は、非常に困難なことがよく知られています。

101 Bio社は、独自の表面特性を有するフィルターと界面活性剤を含まない抽出バッファーを使用して、脂肪組織ホモジネートのエマルジョンからタンパク質を迅速に抽出する手法を開発しました。組織内のタンパク質存在比にバイアスをかけることなく抽出することができます。また、従来法よりも高濃度のタンパク質(2〜3 mg/mL)を抽出することができます。

特長

  • 迅速 - 15分〜20分で抽出完了
  • 高収量 - 2〜3 mg/mL のタンパク質を抽出

構成内容

  • バッファーA(抽出バッファー)
  • バッファーB(10X 変性バッファー)
  • バッファーC(10X 非変性バッファー)
  • マイクロ遠心チューブ(1.5 mL)
  • 乳棒(1.5 mL チューブ用)
  • コレクションチューブ付きタンパク質抽出フィルターカートリッジ
  • タンパク質抽出粉末

プロトコール

A. 脂肪組織(WAT/BAT)のタンパク質抽出方法

  1. 50〜80mgの新鮮組織または凍結組織を、重ねたペーパータオルにはさみ、親指と中指で押すようにして組織の油の一部を取り除きます。ピンセットを使って、付属の1.5mLチューブの底に組織を入れます。(※付属のチューブを使用してください。他のチューブでは、乳棒の形状と合わない場合があります。)
    100mgのタンパク質抽出粉末をチューブの組織に加え、50μLのバッファーAを添加します。 
  2. 付属の乳棒を使用して、1〜2分間程度かけて組織を破砕します。チューブに200〜300μLのバッファーAを加え、さらに30秒間すり潰します。(最初のサンプルが20〜40mg程度で少量の場合、100〜150μLのバッファーAを加えてください。)
  3. チューブに蓋をして、2,000 rpmで1分間遠心します。コレクションチューブにセットしたフィルターカートリッジに、上清を移します。
  4. 蓋を開けた状態にして、フィルターカートリッジを-20℃で20分間インキュベートします。
  5. インキュベート後、蓋を開けたまま2,000 rpmで2分間遠心します。フロースルーに脂肪組織由来のトータルタンパク質が含まれます。抽出されたタンパク質は、水不溶性の細胞成分の影響でわずかに白濁します。水溶性タンパク質の検出のために、希釈してELISAに直接使用することができます。または、水不溶性タンパク質を溶解するために、付属のバッファーBまたはバッファーCで再懸濁することができます。

    A. バッファーBを1/10量加えてください。変性タンパク質溶液を得ることができます。SDS-PAGE、ウェスタンブロット、その他のアプリケーションに最適です。
    B. バッファーCを1/10量加えてください。非変性タンパク質溶液を得ることができます。免疫沈降(IP)、ELISA、その他のアプリケーションに最適です。
    C. 二次元電気泳動を行う場合、2×二次元電気泳動バッファーで希釈してください。

B. 培養脂肪細胞のタンパク質抽出方法

  1. 50 X 106〜100 X 106 の培養脂肪細胞を、低速で遠心して回収します。1.5 mLチューブ内の細胞に1 mLの冷却PBSを加えて再懸濁し、100mgのタンパク質抽出粉末を加えます。
  2. 卓上遠心機で、3,000 rpm、3分間遠心します。上清を完全に除去した後、乳棒を使用して1〜2分間ホモジナイズします。チューブに200〜300μLのバッファーAを加え、さらに30秒間すり潰します。
  3. 2,000 rpmで1分間遠心し、上清をコレクションチューブにセットしたフィルターカートリッジに移します。
  4. 蓋を開けた状態にして、フィルターカートリッジを-20℃で20分間インキュベートします。
  5. インキュベート後、蓋を開けたまま2,000 rpmで2分間遠心します。フロースルーに脂肪細胞由来のトータルタンパク質が含まれます。抽出されたタンパク質は、水不溶性の細胞成分の影響でわずかに白濁します。水溶性タンパク質の検出のために、希釈してELISAに直接使用することができます。または、水不溶性タンパク質を溶解するために、付属のバッファーBまたはバッファーCで再懸濁することができます。

    D. バッファーBを1/10量加えてください。変性タンパク質溶液を得ることができます。SDS-PAGE、ウェスタンブロット、その他のアプリケーションに最適です。
    E. バッファーCを1/10量加えてください。非変性タンパク質溶液を得ることができます。免疫沈降(IP)、ELISA、その他のアプリケーションに最適です。
    F. 二次元電気泳動を行う場合、2×二次元電気泳動バッファーで希釈してください。

Note:

  • 乳棒は再利用できます。75%エタノールでふき取った後、乾燥してください。

使用例

ブタ白色脂肪組織の水-油エマルション

SDS-PAGE(ブタ白色脂肪組織、ニワトリ褐色脂肪組織、ラット白色脂肪組織)

ラット白色脂肪組織のウェスタンブロット解析

トラブルシューティング

ステップ4のインキュベーション時間は、組織ホモジネート中の油相と水相の分離のために重要です。最適なインキュベーション時間を設定するために、以下の簡便な試験を推奨します。

通常の1.5mLチューブに0.5mLのddH2Oを添加後、蓋を開けた状態にして使用予定の冷凍庫でインキュベートします。完全に凍結するまでに必要な最小時間が、最適なインキュベーション時間となります。同様の試験は、-80℃の冷凍庫でも実施可能です。

脂肪組織&脂肪細胞トータルタンパク質抽出キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Total Protein Extraction Kit for Adipose Tissues and Cultured Adipocytes OBL P522-4 4 RXN
¥31,000
Total Protein Extraction Kit for Adipose Tissues and Cultured Adipocytes OBL P522-20 20 RXN
¥87,000
Total Protein Extraction Kit for Adipose Tissues and Cultured Adipocytes詳細データ OBL P522-80 80 RXN
¥302,000

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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