Cytoskeleton（CYT）社 Flipper-TR® プローブについて

蛍光寿命イメージング顕微鏡法とは、Fluorescent Lifetime Imaging Microscopy の略です。膜張力の研究にとって重要なのは、Flipper-TR 以前の膜張力測定は非常に手間であり設備が必要でしたが、今では現在の顕微鏡を比較的簡単に適合させることで、高感度な張力測定が可能になりました。現在、これは多くのサプライヤーから入手可能な機器による非常に標準的な技術であり、蛍光体の励起後に発光が起こるまでの時間を記録することに基づいていています。また、これは非常に速く、1-10 ナノ秒のオーダーとなります。FLIM は、全反射照明蛍光 (TIRF) 顕微鏡や誘導放出抑制(STED) 顕微鏡などの他の高解像度顕微鏡技術と組み合わせて、高い空間分解能を実現することもできます。FLIMには、多くの科学顕微鏡ベンダーが提供している時間分解光検出器 (time resolved light detector) が必要です。例えば、PicoQuant社のupgrade キットなどです。参考文献1では、FLIM 顕微鏡法の実験セットアップについてさらに詳しく説明しています。(Flipper-TR は、スイスの UNIGEM の登録商標です。)

蛍光 Flipper-TR® プローブは、細胞の細胞膜を特異的に標的とすることで機能し、蛍光寿命の変化を通じて膜張力の変化を示します。これは Flipper プローブファミリーの最も先進的なメンバーです^2,3,4,5。Flipper-TR® は、細胞の細胞膜に自発的に挿入され、脂質膜に挿入された場合にのみ蛍光を発します。このプローブは、mechanophore の 2つのねじれたジチエノチオフェン間のねじれ角と分極を通じて、脂質二重膜の組織の変化を感知します (図 2 参照)。緊張状態 (ジチエノチオフェンが整列) では蛍光寿命が長く (4.1 - 8.0 ns)、緩和状態 (ジチエノチオフェンがねじれている) では短く (2.0-4.0 ns) なります。変動 (cv) は 0.3 ns のオーダーで (cv = 4-15%)、膜張力の微妙な変化を高解像度で捉えることができます。通常、寿命が短いものは緑色、中程度のものは黄色、長いものはオレンジ色と赤色で色分けされています (図 2 参照)。

Flipper-TR プローブは、励起ピークが発光ピークより 100 nm 以上短いため、長波長分離フィルター セットで視覚化されます。したがって、理想的なフィルター セットは、励起が 488 +/- 20 nm、発光が 575 〜 675 +/- 40 nm です (図 3)。時間分解測定法では、水性環境での蛍光が低いことに加え、バックグラウンドが非常に低いです。以下の [04] を参照してください。

Flipper-TR プローブは、完全にねじれた状態にあり、ミセルを形成して自己消光する傾向があるため、組織培養培地や固定緩衝液などの水性環境ではバックグラウンドが非常に低くなります^３。膜に挿入されると、ねじれが少なくなり、高い蛍光を発し始めます (図 2 参照)。

はい、プローブは粉末状態で室温で数日間安定します。無水 DMSO (DMSO の古い開封済みボトルは使用しないでください。Sigma社または Spectrum Chemicals社の乾燥 DMSO のアンプルを使用してください。) で再構成した後 、-20°C での凍結および解凍に対して安定していますが、このような条件下では劣化するため、小分けに保管してください。

いいえ、データシートに記載されている条件下では、プローブは毒性を示しません。細胞は、細胞の種類と培養条件に応じて、2 - 4日間生存し、蛍光を発します。

現在、すべての既知の生物が Flipper-TR で染色されています。これには、組織培養細胞、組織切片 (新鮮)、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌などが含まれます。

はい、プローブは 3D 増殖環境で細胞を染色することができます。

量子収率 = 0.30 in ethylacetate

以下は一般的なラベリングプロトコールです。詳細なプロトコールにつきましては、必ずデータシートと公開されている論文を参照してください。

1. 標準的な実験室での細胞培養プロトコールに基づいて、カバーガラス、ガラスボトムディッシュ、またはガラスボトムマルチウェルプレート上で細胞を培養します。細胞が目的の密度に達したら、Flipper-TR を再構成します。各細胞タイプの最適なラベリング条件は、経験的に決定する必要があります。
2. 再構成を行い、Flipper-TR の 1 mM マスターストック溶液を調製します。データシートの指示に従って保管してください。
3. 培養細胞の染色用に、1 mM マスターストックからワーキング溶液を調製します。細胞培養培地で希釈し、1 μM の染色液から開始します。培養培地を染色液に交換します。
4. イメージングの前に、細胞をインキュベーター（37℃、5% CO2、加湿環境）に 15 分間戻します。
5. 485または488 nmのパルスレーザーを使用して励起し、600/50 nmのバンドパスフィルターを通して光子を収集する標準的な FLIM 技術で染色した細胞を画像化します。光による損傷を最小限に抑えるために、ラベリングの手順および画像取得の設定を最適化することをお勧めします。 注意： 膜張力の測定は FLIM でのみ行うことができます。（蛍光強度または波長は信頼できません。)