Q&A : マルチゲルについて（トラブルシューティング等）

未変性系では、サンプルの移動度はタンパク質の電荷や分子構造の影響を受けるため分子量の推定はお勧めできません。分子量の推定は、SDS-PAGEで行ってください。

SDS分子はマイナスに荷電し分子量も非常に小さいので通電と同時にどのタンパク質よりも早くゲルの中に入っていきます。従って、SDS入りのゲルで泳動しているのとほとんど同じ状態になります。

タンパク質分子内または分子間にS-S結合が存在するからです。このS-S結合をβメルカプトエタノール等の還元剤で切断すると分子構造が変化したり、サブユニットに分離したりするので移動度が変化します。

使用可能ですが、トリス-グリシンバッファーを使った場合と分離パターンが変わります。マーカーなどで分離パターンや分析レンジを確認してからご使用ください。

製造後の時間が長くなると、ゲルの酸化が進行します。この結果、泳動中にガラス板とゲルの間に気泡が発生したり、ゲルの下端が伸びてガラスからはみ出るというような現象が起こります。これらはいずれも泳動像の乱れの原因となります。プレキャストゲルの使用期限は、上記現象を総合的に判断して設定しております。つきましては、期限の過ぎた製品のご使用はお控えください。

核酸を銀染色する場合は、ゲル中にホルムアルデヒドが入っているものは染色できません。グリセロールだけ入っているゲルは染色できます。

ゲル全体が染まってしまうので使用できません。

銀染色試薬では、可能です。2D-銀染色試薬・II ではデータがありませんが可能だと思われます。

固定液I あるいは固定液II に浸した状態で中断してください。長時間中断する場合は、試薬の蒸発を防ぐため蓋をしてください。

脱色してもう一度染め直すことができます。この時使用する脱色液の処方は下記の通りです。

Ａ液　NaCl　14.8 g
CuSO₄ 14.8 g
H₂O　340 ml
NH₄OH　適量※
精製水で全量　400 ml
※沈殿物が溶けるまで加えて下さい。

Ｂ液　Na₂S₂O₃ 174.4 g
製水で全量　400 ml

Ａ 液とＢ液を１：１に混合し、更に精製水で10倍希釈したものを脱色液とします。なお、脱色しすぎた場合、染色像も同時に消えますので注意してください。脱色液中で振とうして、染色像が適当になったところで10％酢酸溶液を加えて脱色を停止してください。その後、十分水洗いして保存してください。

脱色液（75 ml酢酸、50 mlメタノールに精製水を加え全量1Lにする）で十分脱色してから銀染色の操作を行ってください。

1時間程度なら10％トリクロロ酢酸に浸しておくことができます。一昼夜中断する場合は50％メタノールに浸した状態で中断してください。この場合、試薬の蒸発を防ぐため蓋をしてください。また、振とうはしないでください。

同程度に染色できます。

可能です。

但し、2D-銀染色試薬・II の構成試薬の中で、前処理剤にはグルタルアルデヒドが入っていますので、試薬調製時に前処理剤を除いてお使いいただくことになります。

構成試薬の中で前処理剤は、タンパク質の種類による染色ムラを防ぎ、ある程度同じ色調に染めるために使用します。前処理剤を使用しなくても検出感度が変わるということはございませんが色調が多少茶〜黄色っぽくなることがあります。また、タンパク量が多い場合、染まりにくいものがあるかもしれませんのでご了承ください。

試薬の調製及び染色時間（マルチゲル®II ミニ 2枚分）
（1） 固定　10分 メタノール100 ml＋酢酸20 ml＋精製水⇒200 ml
（2） 固定　15分 メタノール　60 ml＋酢酸20 ml＋・固定化剤10 ml＋精製水⇒200 ml
（3） 前処理　10分 メタノール　100 ml＋精製水⇒200 ml ＊前処理剤は使用しません。
（4） 水洗　5分
（5） 銀染色　15分 染色液Ａ10 ml＋・染色液B10 ml＋精製水⇒200 ml
（6） 水洗　2分×3回
（7） 現像　10分以上 現像原液10 ml＋精製水⇒200 ml
（8） 停止 停止液をそのまま使用します。

銀染色試薬中の銀含有量は低濃度であり、有害性は極めて低いものですが、BOD，COD等の排水基準を考慮し、弊社では塩化銀の沈殿物にしていただいた後、専門業者への引き取りを推奨しております。染色液を間違って流した場合は、大量の水で洗い流してください。

濃塩酸を流してしまった場合、排水のｐHなど、別の問題が発生する可能性があります。トリクロロ酢酸を使用した場合、弊社ではアルカリと中和して大量の水とともに流しております。

核酸染色の場合、タンパク質とは異なる固定（トリクロロ酢酸固定）を行います。またキット中の固定化剤及び前処理剤を使用すると反応を阻害するため、固定の後はすぐ銀染色にうつります。 逆にタンパク質を染色する場合、固定化剤及び前処理剤を使用しないと、バンドが黒く染まらないという弊害が発生します。従いまして弊社としては、両者の同時染色というのは推奨しておりません。

尚、弊社ではゲルの材質はアクリルアミドで、泳動バッファーは、トリス-グリシン系を使用しております。泳動条件が上記以外の場合、タンパク質と核酸をそれぞれのプロトコールで染色しても2D-銀染色試薬・II が適用できない場合がありますのでご注意ください。

MSDS には、「酢酸、メタノールを含む色素製品であるため、排水溝には絶対流さぬこと。産業廃棄物処理認定業者に委託して処理すること。該当法規に従い廃棄物を処理すること」と明記してあり、実際弊社でも染色液及び脱色液廃液は専用タンクに保管して、定期的に業者に引き取ってもらっています。

含まれていません。構成試薬（3）の染色液Aに硝酸銀が入っていますが、濃度が低いため、該当しません。

製品添付のプロトコールはゲル割れを極力避けるために、処理時間を長めに設定しています。濃度の薄いゲルならば「多少」短縮しても問題ないでしょう。しかし、短くすればするほどゲル割れの可能性が高くなる事は理解していただいた上で検討してください。具体的な短縮可能時間については、ゲル濃度、温度、湿度など多くのファクターの影響を受けるために一概には言えません。 逆にゲルの白濁がひどい場合は短めに処理したほうがよいでしょう。

大丈夫です。しかし脱色の状態が異なるために従来法と比べるとややバランスが変わる可能性はあります。

乾燥中にゲルが白濁した場合は、フレームから外さずに軽く水をかけて濁りを除いた後、余分な水を拭き取って再乾燥してください。

使用できます。最初のステップの3回の水洗によって尿素やバッファー成分は洗い流されるので影響を受けません。

メンブランを風乾後、転写面に触れないように注意しながらラップに包み、4℃で保存してください。保存したメンブランを使用する場合は、100％メタノールに再度浸した後、水洗してメタノールを除き、ブロッティング液に浸してください。

可能です。

PVDFメンブレンは、疎水性が極めて強いので直接バッファーに浸しても濡らすことができません。予めメタノール処理するとバッファーで濡らすことが可能になります。このメタノール処理を確実に行わないとタンパク質が膜に結合しません。