標準曲線のプロットは、線形対数法を使って行うことができます。標準曲線作成には 4パラメータロジスティック回帰 (4PL) を推奨します。曲線は、各標準の平均吸光度を垂直 (Y) 軸にプロットし、それに対応する濃度を水平 (X) 軸にプロットすることによって構築します。結果計算には、線形-対数曲線の直線部分が最も信頼できる部分にあるためこの部分を使用します。曲線が対称でない場合、5PL回帰を使用すれば、より良いフィットが得ることができます。カーブフィッティングのオンラインリソースは、こちら 
をご覧ください。ELISAプレートリーダーに付属のソフトウェアが直線回帰を実行できることを確認してください。
ロット番号が異なる同じ構成品の混合はお奨めしません。すべてのロットは別途製造され、最適化されています。したがって、ロットが異なる構成品を混合して使用される場合、結果を保証することはできません。Hycult Biotech社では、ロット特異的な構成品セットと既知の濃度のサンプルを使い、日差再現性及び同時再現性をテストしています。これら試験は、ロット間差を最小限に抑えるために行われています。
マニュアルに記載がないサンプルタイプを使用される場合は、アッセイ前にリカバリー試験を行うことをお奨めします。リカバリー試験により、タンパク質検出に対して影響を与える物質がサンプル中にあるかどうかを確認することができます。希釈サンプルと希釈バッファーの両方に、既知量の標準液を加えます。アッセイでは二重 (duplicate) 測定し、正常サンプルに対するリカバリー率を計算します。リカバリー率が 80〜120 % 範囲内にある場合は、そのサンプルは問題なく使用できます。リカバリー率がこの範囲外にある場合、干渉物質の影響が出なくなるくらいサンプル希釈することをお奨めします。
マニュアルに記載されている希釈は、マトリックス効果を防ぐための最小希釈率になります。サンプルタイプに応じて、より高い希釈率が必要な場合があります。
プレートウォッシャーまたは自動ワークステーションを使用すると、バックグラウンドが高くなり、感度が低下する可能性があります。マニュアルに記載されている操作と比較・検証することをお奨めします。
