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Q&A

記事ID : 43507

Lucigen (LUC) 社 LavaLAMP™ RNA Master Mixについて

【01】 LavaLAMP RNA Master MixはDNAに使用できますか?

LavaLAMP RNA Master MixはRNAターゲットに最適化されており、DNAターゲットとの最適化はされていません。 そのため DNAをターゲットとする場合、キットは動作しますが、性能は低下します。

【02】 ターゲットに合わせたプライマーの設計がよくわかりません。どうしたらよいですか?

各ターゲット(FIP, BIP, Loop-F, Loop-B, F3, B3)に対して、6セットずつプライマーを設計する必要があります。 新しいアッセイを開発する際には、複数のセットを比較し、最適なプライマーセットを特定することを推奨致します。

【03】 標的RNAに対して、6本のプライマーではなく、4本のプライマーを使用することはできますか?

4種類のプライマー(FIP, BIP, F3, B3)を使用することはできますが、アッセイ速度が遅くなり、また感度も低下します。 結果としてアッセイに支障をきたす可能性が高いです。

【04】 LavaLAMP RNA Master Mix with Dyeに含まれるGreen Fluorescent Dye以外の色素を使用することは可能ですか?

はい、使用できます。Syto-13(Molecular Probes)、EvaGreen(Biotium)、V13-01184(Dyomics)がLavaLAMP RNA Master Mixでテストされ、良好な結果が得られています。

【05】 LavaLAMP RNA Master Mixに色素を添加し、4℃で一晩保存してもよいですか?

いいえ。色素を添加した後は、速やかに反応させる必要があります。

【06】 陽性コントロールのテンプレートには何コピーが含まれていますか?希釈は必要ですか?

コントロールテンプレートは 30,000 コピー/µL (0.060 pg/µL) 含まれており、希釈せずにそのまま使用することができます。

【07】 LavaLAMP RNA Master Mixを一晩ベンチに置いたままにしてしまいました。まだ使えますか?

はい、LavaLAMP Master Mixは、室温で一晩放置しても安定です。
しかし、複合試薬(反応ミックス、プライマー、色素)の室温での安定性を裏付けるデータはございません。

【08】 Master Mixを凍結乾燥することは可能ですか?

はい、可能です。LavaLAMP RNA Master Mixは、凍結乾燥が可能なように調合されています。 具体的な凍結乾燥条件については、凍結乾燥機のユーザーマニュアルをご参照ください。

【09】 なぜ増幅のエビデンスが見られないのでしょうか?

  • プライマーの設計が悪い可能性があります。 すべてのプライマー設計がうまく機能するわけではない為、最良の結果を得るために複数のプライマーセットをテストしてください。各プライマーの Tm は、LavaLAMP RNA Master Mix のユーザーマニュアルに記載されている通りに設定してください。
  • 反応は65℃で行っていませんか?LavaLAMP酵素は68℃から74℃の間で最も活性が高くなります。必ずこの温度範囲内で反応させてください。
  • PCRやBst DNA Polymeraseの反応条件を使用した可能性があります。 これらの反応条件は、LavaLAMP™ RNA Master Mixと互換性がありません。
  • Primerの濃度や比率が正しくない可能性があります。
    10X LAMP Primer Mixは以下のようになります。
    ・F3、B3プライマー:各2 µM
    ・Loop-F、Loop-Bプライマー:各8 µM
    ・FIPおよびBIPプライマー:各16 µM
  • サンプルに含まれる汚染物質が反応を阻害した可能性があります。RNAを精製するか、またはサンプルを希釈してください。
  • ターゲットRNAの配列がプライマーデザインと一致していない可能性があります。
     また、購入した標的株が、プライマー設計に使用した株と異なる可能性があります。
  • 装置で不適切な蛍光設定が選択された可能性があります。 蛍光光度計のFAMチャンネルを使用ください (テストした装置のユーザーマニュアルをご参照ください) 。

【10】 テンプレートなしコントロール (NTC) で、シグナルが早く出てしまうのですが、コンタミネーションでしょうか?

  • サンプルやキットの試薬に対象物が混入している可能性があります。反応液の調製は検体とは別の場所で行い、クロスコンタミネーションを防いでください。
  • インキュベーションの温度が最適ではない可能性があります。68℃〜74℃の範囲で最適な結果が得られますが、これはプライマーセット毎に決定する必要があります。
    最適温度は、陽性サンプルのTTRとNTCのTTR(ΔTTR)の両方に基づいて選択する必要があります。
  • プライマー設計が悪い可能性があります。複数のプライマーセットをテストし、最も性能の良いプライマーセットを決定ください。
  • プライマー濃度が高すぎる可能性があります。Lマニュアルの推奨濃度を超えないようにして下さい(上記Q9もご参照ください)。
  • 試薬の調製等を氷上で行わなかった場合、非特異的な増幅が起こる可能性があります。

【11】 ゲル上にバンドが1本だけでなく、ラダー状に並んでいるのはなぜですか?

このパターンは正常であり、LAMP反応中に生成される様々なループコンカタマーを表しています。

【12】 サンプルとNTCのTTRの差(ΔTTR)は、どの程度まで許容されますか?

ΔTTRは、ターゲットおよびプライマーセットに依存します。一般に、確実に検出できる最低濃度のターゲットを使用した場合、サンプルとNTC間のΔTTRは最低でも5分が必要です。

【13】 陽性コントロールのように68℃で反応がうまくいきませんでした。これはなぜですか?

コントロール反応はキット付属のRNA Positive Control LAMP Primer Mixで最適化されており、68℃で最もよく機能します。
各ターゲットは、適切に設計されたターゲット特異的なプライマーと最適な温度が必要です。
新しいターゲットとプライマーセットの反応温度は、パフォーマンスを最大化するために最適化する必要があります。

【14】 エンドポイントアッセイで、NTCシグナルがターゲットシグナルと同じになってしまいました。なぜですか?

反応時間が長すぎたため、バックグラウンドのNTCシグナルが最大サンプルのシグナルに追いついたと考えられます。これは、プライマーのダイマー化、または非特異的なプライマーのアニーリングや伸長現象によるものと思われます。(Q10も併せてご覧ください)

【15】 エンドポイントアッセイではなく、リアルタイムアッセイを実施することは可能ですか。

はい。リアルタイムアッセイは、ターゲットとNTCの両サンプルについて、反応の進行を経時的に容易にモニターできるため、推奨されています。

【16】 準備する試薬等のグレードを教えてください。

  • 水: 分子生物学グレードで、ヌクレアーゼ、プロテアーゼが含まれていないもの。
  • プライマー:FIPおよびBIPプライマーは、HPLCによる精製が必要です。Loop-F、Loop-B、F3、B3については、標準的な脱塩を使用することができますが、すべてのプライマーについてHPLC精製を行うことが最適な結果をもたらします。

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