FAQ：InvivoGen（ING）社　マイコプラズマ検出キットについて

InvivoGen の MycoStrip™ によるマイコプラズマの検出は、65°C の一定温度で DNA を指数関数的に増幅する堅牢な技術である等温 PCR に基づいています。 当社独自の反応ミックスを使用すると、細胞培養で最も一般的に見られるマイコプラズマ種（汚染の 95% を占める）の 16S rRNA 遺伝子が標的化され、増幅されます。 結果はイムノクロマトグラフィー ストリップ上のバンドとして迅速に視覚化されます。

結果の信頼性を監視し、トラブルシューティングの場合に備えて、ポジティブ コントロールとネガティブ コントロールを定期的に含めることが重要です。

ポジティブコントロールはマイコプラズマ汚染源ではありません。DNA の断片のみが含まれています。

心配する必要はありません。哺乳動物細胞 DNA の存在は検出アッセイに影響を与えません。

サンプルは次のように保管できます：

• 細胞培養上清：「サンプルの調整」プロトコルを開始する前に、必要になるまで細胞培養上清を -20℃で保存できます。
  使用前にサンプルを 37℃で完全に解凍し、すべての塩が確実に溶解するようにボルテックスでよく混合します。
• 準備されたサンプル：「サンプルの準備」プロトコルのステップ 1~4 を実行した後、サンプルは必要になるまで -20℃で保存できます。
• 処理済みのサンプル：「検出アッセイ」プロトコルのステップ 1~4 を実行した後、処理済みサンプルは -20℃で最長 3 か月間保存できます。

サンプルの 1 つで、かすかなバンドが観察された場合、これはマイコプラズマ汚染の陽性結果であると考えられます。次のヒントのいずれかを使用してこの結果を確認することをお勧めします。

• サンプルを濃縮します。大量の上清から始めるか、「サンプルの調製」プロトコルのステップ 2~3 を繰り返します。MycoStrip™ を使用して濃縮サンプルを再検査します。
• MycoStrip™ を使用して再テストする前に、さらに 48 時間培養を続けます。
• PBS の代わりに滅菌水を使用してサンプルを再懸濁します (テストの感度を高めるため)。

MycoStrip™ は感度が高く、1mL あたり10²個のゲノムコピーまで検出できることが検証されています。

MycoStrip™ は、クロストリジウム、乳酸桿菌、連鎖球菌など、系統発生的に関連する微生物を一切検出しません。同様に、水系細菌であるバーグホルデリアも検出されません。MycoStrip™ の特異性は、モリクテス属、非モリクテス属細菌、および真核細胞/組織サンプルの DNA 抽出物で評価されています。さらに、真核生物 DNA との交差反応性は観察されませんでした。検出および検査されたすべての種の完全なリストについては、コチラの仕様欄をご参照ください。

他のマイコプラズマ検出キットとは異なり、必要なのはサーモサイクラーのみです。

サンプルの準備にはわずか 10 分しかかかりませんが、検出アッセイには 10 分の手作業を含めて 60 分かかります。結果は 5 分以内にバンドとして視覚化されます。

MycoStrip™ テストには、継代前の浮遊または接着細胞培養からの細胞培養上清、またはウシ胎児血清 (FBS) などの細胞培養培地成分が1mL必要です。

MycoStrip™ は、マイコプラズマを検出するための堅牢かつ高感度で、非常に簡単な方法です。MycoStrip™ のスピードと利便性により、培養細胞および一般的に使用される完全培地の成分 (FBS など) の日常的な検査が可能になります。最小限の実践時間で簡単に解釈できる結果が迅速に得られます。計算や類似色の識別、アガロースゲルの泳動は必要ありません。

いいえ、細胞に抗生物質を使用してもアッセイには影響しません。

感度は向上しませんが、このステップによりマイコプラズマが死滅し、生きたマイコプラズマを扱う必要がなくなります。

はい、PBSの代わりに水を使用することも可能です。

サーマルサイクラーがない場合は、代わりに校正済みのヒートブロックまたはウォーターバスを使用できます。ウォーターバスを使用すると、新たな汚染源が発生する可能性があることに注意してください。

65℃で 40 分間のインキュベーションを超えるとアッセイの結果に大きな影響を与えるため、このサンプルの使用はお勧めしません。

等温 PCR は非常に敏感な方法であるため、ヒートブロックは正確に 65°C で行う必要があります。
温度が高くなると反応が阻害されます。
ヒートブロックの温度を制御するか、サーマルサイクラーに切り替えることをお勧めします。

使用される最も一般的なマイコプラズマ検出検査は PCR ですが、この技術には欠点があり、特に、研究室で PCR を定期的に実行しない場合、taq ポリメラーゼの安定性や、 dNTP、バッファー等、他のすべての PCR 試薬の無菌性により問題が発生する可能性があります。
PlasmoTest™ は、細胞培養におけるマイコプラズマ汚染を視覚的に比色検出するための初の細胞アッセイです。必要なのは基本的な細胞培養の知識と、実践時間 1 時間未満のみで、一晩のインキュベーション後に結果が得られます。最も重要なことは、陽性結果は細胞培養汚染物質の存在を示すため、偽陽性が存在しないことです。

PlasmoTest™ はマイコプラズマ リポタンパク質の存在を検出するため、細胞培養中の生きたマイコプラズマと死んだマイコプラズマの両方の存在を示します。

PlasmoTest™ は TLR2 の活性化に依存しています。したがって、マイコプラズマと細菌の両方の汚染物質を検出できます。ただし、マイコプラズマは肉眼では検出できませんが、細菌の汚染は目に見えて確認でき、細菌の増殖により pH の低下 (培地の色が黄色に変化) と培地の濁りが生じます。

吸光度を読み取るには、620 nm~655 nm の波長が最適です。このスペクトル部分に到達できないプレートリーダーの場合は、600~680 nm の信号を受信できることに注意してください。SEAP を使用した場合と使用しない場合の QUANTI-Blue の分析に基づいて、350~700 nm の吸光度を見ると、600 nm~680 nm までシグナルが得られますが、飽和が低く、バックグラウンドが高くなる可能性があります。

上清に含まれる細胞外のマイコプラズマだけでなく、細胞内のマイコプラズマが存在する場合にはその検出も可能となるため、上清とともにいくつかの細胞を収集することが重要です。

検査対象の上清の血清中に存在し得るアルカリホスファターゼは結果を妨げる可能性があるため、これを除去するために、すべてのサンプルを加熱する必要があります。
加熱ステップにより、サンプルに残っているマイコプラズマを除去して汚染の拡大を防ぐこともできます。ただし、細胞培養 (細胞なし) および再懸濁した HEK-Blue™ 検出に使用したテスト培地のみをテストしてみることもできます。培地が青色にならない場合は、加熱ステップをスキップできますが、この潜在的に汚染されたサンプルの取り扱いには十分注意してください。

これらのコントロールに関する情報は開示できませんが、陽性コントロールは生きたマイコプラズマではないのでご安心ください。

PlasmoTest™ の開発時に、一部のトリプシンまたは血清は (無菌汚染から) TLR2 応答を誘導し得るが、PBS からは全く誘導しないことが示されています。1/1000 を超える DMSO は HEK Blue 細胞にとって有毒であり、比較的高いバックグラウンドノイズを引き起こす可能性があります。ネガティブコントロールとして上清と並行して、培地のみをテストすることが有用です。

すべてのウェルで青色が観察される理由については、次の 3 つの説明が考えられます。

1. 培地中にアルカリホスファターゼ (AP) が存在することが原因である可能性があります。これに当てはまるかどうかを確認するために、非常に簡単なテストを実行できます。細胞培養に使用した培地 (細胞なし) 50 µL と再懸濁した HEK-Blue™ 検出液 200 µL を加えるだけです。培地が青くなった場合、それは培地の血清中の AP によるものです。この場合、培地を加熱して AP を除去し、同じテストをやり直す必要があります。この時点で、テストは青色であってはなりません (培地 + 検出培地では陰性結果が得られるはずです)。
2. 培地が HEK-Blue™ 検出培地と反応しない場合、問題は細胞 (HEK-Blue™ -2 細胞) が汚染されていることが原因である可能性があります。この場合、最善の選択肢は、 (在庫が残っている場合）新しい細胞バイアルを使って最初からやり直すことです。また、細胞懸濁液の汚染を避けるために、フィルターチップ付きのピペットを使用することが最善であることに注意してください。
3. テスト前の細胞の取り扱いが不適切であることが原因の可能性があります。バックグラウンドレベルを下げ（刺激前のNFkBの活性化が制限されるため）、それにより偽陽性結果のリスクを制限するためのヒントをいくつか紹介します。
   
   • あらかじめ温めたPBSを使用して細胞を洗浄する
   • 加熱不活化FBSを使用する（FBSの一部ロットには、滅菌されていても、HEK-Blue™-2細胞を活性化する可能性のある微生物の残骸が含まれています）
   • 刺激前に細胞を遠心しない
   • トリプシンを使用しない

• OD (ポジティブコントロール): 0.9 - 1.2
• OD (ネガティブコントロール): < 0.2

サンプルが無菌であり、室温で無菌状態に保たれていた場合、結果は同じになります。
ただし、すぐに検査できない場合は、サンプルを -20℃ で (数日間) 凍結することをお勧めします。

分割比は、いつコンフルエントになると予想されるかによって異なります。通常、HEK-Blue™ 細胞の倍加時間は約 24 時間です。したがって、新しいフラスコに 1:2 (50%) で継代すると、翌日には細胞がコンフルエントになるはずです。1:4 (25%) で継代すると、2 日後に細胞がコンフルエントになることが期待できます。

実際、ポジティブ コントロールは半透明の脂質フィルムであり、多くの場合、肉眼で観察するのが困難です。一方、ネガティブコントロールは目に見える粉末です。

当社には血漿および血清サンプルのテスト経験はほとんどありませんが、PlasmoTest™ キットの HEK-Blue™-2 セルに対しては実施されています。
標準サンプル (DMEMサンプル) を使用した場合と比較したところ、血清サンプルでは1 log分の差がみられました。（例：DMEMでは最大10³ UFC/mLのMycoplasmae Fermentansが検出されるのに対し、血清では最大10⁴ UFC/mL が検出されます。） 一方、血漿サンプルでは、DMEMサンプルと比較して、3logの違いがあることがわかりました。（例：DMEMでは最大10³ UFC/mLのM. hominisが検出されるのに対し、血漿では最大10⁶ UFC/mL が検出されます。）よって、血漿サンプルよりも血清サンプルを使用することをお勧めします。