FAQ : ORIGENE（ORG）社 Trilencer-27（デザイン済み）siRNA製品について

従来型の21mer2本鎖RNAは、長鎖RNAがDicerにプロセスされて生ずる天然のsiRNAを模倣しています。これに対して27mer siRNAはDicerプロセシングをうけて21mer siRNAが生ずる天然の流れを介します。 従来の21mer siRNAに比べてDicer-基質を利用するアプローチでは、 同一部位を標的した場合に10倍程度高い効果を示す可能性が示唆されています。

配列のBlastを行い標的遺伝子のみと相同することを確認、2次構造確認、RISC複合体への取込みを考慮して2本鎖の安定性を確認するといった種々のスクリーニングを行っている点です。

3種類の2本鎖siRNAをそのままトランスフェクションや遺伝子ノックダウン実験にご利用ください。トランスフェクション後、 細胞を可溶化し標的タンパク質に対する抗体を用いてウェスタンブロット解析を行いsiRNAの機能確認を行うか、またはトランスフェクションした細胞を回収し定量PCRを行って遺伝子発現低下を確認します。必要であれば、検証済みsiRNA標的配列をORG社のレトロウイルスプラスミドベクターにexact-si/shRNAカスタムサービスを利用して組込み、shRNAプラスミドを導入して定常発現株を構築することもできます。

キットとともにご提供するコントロールはuniversal scrambled negative control duplex （品番:SR30004）です。
その他、コントロールとして下記のものをご用意しています。
・TYE 563-labeled transfection control RNA duplex （品番：SR30002）
・HPRT1 Positive Control duplex （品番：SR30003）

siRNA発現による非特異的効果を除外するため、ORG社ではネガティブコントロール （品番：SR30004）をご提供しています。この2本鎖は遺伝子特異的ノックダウン実験においてネガティブコントロールとして機能し、インターフェロン応答を誘導しないと考えています。

siRNA kitには下記のものが含まれます。
・3種類のDicer基質2本鎖RNA：各2nmol
・1種類の2本鎖ネガティブコントロール：2nmol
・RNase-freeの再溶解バッファー
qSTARプライマーセット および SYBR Green master mix もご用意しています。詳細は下記をご覧ください。

実際の標的遺伝子抑制レベルはトランスフェクション効率にも依存します。実験を行う際には、トランスフェクション効率の確認のためHPRT siRNAなどのポジティブコントロールを同時に使用する必要があります。さらに、例えば 0.1〜50nMといった濃度幅で Trilencer-27を使用し、最大ノックダウン効果が得られるsiRNA濃度を決定します。一般的に、至適濃度は1〜50nMsiRNAですが、10nMにおいて有効な場合が多いようです。

ORG社では、10nM濃度で本品を導入しqPCRで評価した際、キットに含まれる3種のDicer-Substrate duplexesのうち少なくとも2つが、標的遺伝子に対して最低70%以上のノックダウン効果を示すことを保証しています。ただし、同時にTYE-563 2本鎖蛍光トランスフェクションコントロール （品番：SR30002）において90%より多くの細胞がトランスフェクトされ、HPRTポジティブコントロール （品番：SR30003）において90%のノックダウン効果が確認できていることが条件です。
ノックダウン効果の保証に関するお問合せは、RNAi@cosmobio.co.jp までご連絡ください。トランスフェクション効率のデータを始め、スクランブルsiRNAコントロールと比較した遺伝子発現抑制の測定結果（定量RT-PCRデータが必須）をご提供ください。

はい。siRNAトランスフェクション用に調製された試薬を使用することが重要です。ORG社では、siRNA単独導入またはsiRNAと発現プラスミドとの同時導入に使用できるsiTran 1.0 （品番：TT300001）をお奨めしています。