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FAQ : Enzo Life Sciences(ENZ)社 PKAキナーゼアッセイ (品番ADI-EKS-390A) について

【01】 本キットで提供されているポジティブコントロールは何ですか?

sf9細胞で発現させたリコンビナントヒトPKAc β(PKAの触媒サブユニットCβ) です。

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【02】 本キットの原理を教えてください。

本キットは様々な種に由来する異なるサンプルタイプ (精製済み、部分的に精製済み、粗精製酵素) の相対PKAキナーゼ活性を定量します。基質であるペプチドがマイクロタイタープレートにコートされており、活性型PKA酵素とATPが存在するとペプチドはリン酸化されます。リン酸化特異的抗体、続いてHRP標識二次抗体、TMB基質を順次添加し、リン酸化ペプチドの定量を行います。生じた呈色強度を450nmで読み取りますが、強度はPKAリン酸基転移酵素活性に比例します。

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【03】 ポジティブコントロールが適切に働いていないようです。原因は何でしょうか。

タンパク質は注意深く扱わないとすぐに分解してしまいます。必ず-70℃で保存してください。また、1回以上に分けて使用する場合は、気を付けて分注操作を行ってください。

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【04】 キットプロトコールで推奨している溶解バッファーの代わりに自分の溶解バッファーを使うことはできますか?

キットプロトコールで推奨しているバッファーは開発者により最適化されたものです。他のバッファーでも使えるかもしれませんが、テストされているものはプロトコールに記載してある溶解バッファーのみです。

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【05】 サンプル中のPKA濃度を測定できますか?

できません。相対PKAキナーゼ活性を調べることを目的にしています。

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【06】 ヒト以外の種についても使用できますか?

本キットは種に依存しません。サンプルに十分なPKA活性があり、適切に処理されれば測定できます。

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【07】 スタンダードとサンプルを3重測定 (triplicate) した際、ウェル間でばらつきがみられました。値は範囲内でしたがばらついています。理由は何でしょうか。

ウェル間のばらつきは、混合不足の可能性があります。プロトコールに示されている通り、穏やかに混合してください。

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【08】 プロトコールにはPKA酵素はポジティブコントロールとして提供されていると記載されています。スタンダードカーブを作製する際に用いることはできますか?

キットで提供されている活性PKAキナーゼはポジティブコントロールであり、スタンダードカーブ作成用酵素ではありません。PKAの濃度はロット間で異なり、濃度情報はバイアルのラベルに記載されています。この濃度はポジティブコントロールの滴定を計測するために使用します。滴定を行うことで、活性キナーゼが飽和状態になる時点を教えてくれます。コントロール酵素は構成品の残りが働いているか、そして残りのアッセイについて最適なパラメータを確立することを助けます。

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【09】 プレートにコートされている基質ペプチドはPKAに特異的ですか?

いいえ、基質ペプチドは PKAに特異的ではありません。そのため、他のセリン/スレオニンキナーゼによりリン酸化されます。未精製サンプルを用いる際にはこのことを考慮に入れなければなりません。粗精製の溶解産物でも結果は生じますが、生じたシグナルがPKA活性のみを表しているかどうかを確かめることは困難です。打開策としてはプロトコールに記載されている通り、サンプルを精製することです。その他の方法としては、他のキナーゼ活性を特異的に減少させるようなキナーゼ阻害剤を添加することです。

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