FAQ : 生菌測定PCR用 PMA／PMAxx™色素について

生存率PCRは、もともとEMA（エチジウムモノアジド）を使用して死細胞DNAを不活性化しました。 Biotium社は、モンタナ州立大学の研究者と共同でPMA（プロピジウムモノアジド）を開発しました（Nocker et al.2006）。 PMAはEMAよりも死細胞に対してより選択的であり、生存可能な微生物やウイルスの選択的検出に広く使用されるようになりました。 PMAxx™はBiotium社の最新の生存率PCR色素であり、死細胞DNAのPCR増幅を排除する上でPMAよりも効果的に設計されています。 したがって、生菌と死菌を最もよく区別できます。
詳細は、こちらをご参照ください。

PMAと PMAxx™両方について、20 mMの水溶液で提供いたします。
また、よくDMSOに溶かす必要があるかどうかという質問をよく受けることがあります。一部の文献では、PMAの原液をDMSOで調製していますが、これは必要ではありません。水に溶けないEMAとは異なり、PMAとPMAxx™は非常に水に溶けやすい性質を持っています。

生細胞と死細胞を区別する能力について、PMAとPMAxx™を比較したところ、テストしたすべての細菌株*において、PMAxx™がより優れた活性を示しました。したがって、すべての細菌株をテストしたわけではありませんが、細菌の生存率PCRにPMAxx™を推奨します。

多くのユーザーは、環境サンプルを用いた生存率 PCRでPMAの使用に成功していますが、これらのサンプルは純粋培養よりも難しい場合がございます。

• 水サンプル：

  水サンプルで生存率PCRを行うために、一部のユーザーは0.45 umのフィルターに微生物を濃縮し、フィルターをPMAで処理する方法を開発しました。
  プロトコルは以下の文献をご参照ください。
  Ditommasso S., et al. (2015) Viability-qPCR for detecting Legionella: Comparison of two assays based on different amplicon lengths. Mol. Cell Probes. doi: 10.1016/j.mcp.2015.05.011.

• 不透明または複雑なサンプル：

  PMAを用いたViability PCRは、下水や土壌など様々な複雑なサンプルタイプで成功した例が報告されています。PMAxx™を用いて、複雑なサンプルでの報告はまだありませんが、PMAと同等かそれ以上の効果が期待されます。複雑なサンプルで考慮すべき点は、色素濃度と光の透過性です。通常、色素の一部はサンプル中の汚染物質と結合する可能性があるため、より高い色素濃度（100 µM以上）が必要とされます。また、光がサンプルを透過しにくくなるため、長時間の光処理と光処理中の攪拌が必要となる場合があります。
  プロトコルは、以下をご参照ください。
  Ditommasso S., et al. (2015) Viability-qPCR for detecting Legionella: Comparison of two assays based on different amplicon lengths. Mol. Cell Probes. doi: 10.1016/j.mcp.2015.05.011.

PMAを用いたViability PCRは、何十種類もの生物、様々な種類のサンプルを用いて、何百もの論文で発表されています。詳細については、PMAの論文リストをご覧いただくか、ご興味のあるアプリケーションの文献検索をご利用ください。

PMA および PMAxx™ 染料は、光から保護されている限り、化学的に安定です。HPLC分析により、常温で10日間放置しても影響がないことを確認しています。

標準的な生存率PCRアッセイプロトコルでは、PMA処理後、PCRのテンプレートとして使用する前にDNAを細胞から精製する必要があると述べています。 しかしながら、PMA処理後の細菌細胞ライセートを生存率 PCRに使用することに成功したという報告があります。 主な注意点としては、ライセートを調製する前に、すべての色素が効率的に光分解されることを確認することです。 ライセート中の未反応のPMA色素は、DNAまたはポリメラーゼに結合することによりPCR反応を阻害する可能性があります。 これを検討している場合は、溶液から過剰な遊離色素を除去するために、色素と光処理の後に細胞をペレット化することをお勧めします。 さらに、対照実験を実施して、PCR阻害をもたらさない理想的なPMAおよび光線治療条件を決定する必要があります。

PMAおよびPMAxx™は、膜が損傷した死細胞のDNAを選択的に修飾する膜不透過性色素です。 したがって、PMA処理の前にサンプルを凍結しないでください。これにより、生細胞膜が色素に浸透し、生/死の識別が失われます。

PMA処理および光分解後、PMAまたはPMAxx™は死細胞のDNAと共有結合し、溶液中の過剰な色素は光分解され、反応しなくなります。この時点で細胞を凍結保存し、DNA抽出とPCRを行うことができます。細胞を完全に回収するためには、細胞をペレット化し、上清を除去してから凍結することをお勧めします。

PMA および PMAxx™ は、光に非常に敏感です。光に曝されると、たとえ部屋の光であっても、色素分子に化学変化を引き起こします。したがって、PMA および PMAxx™ のバイアルは、暗い部屋または非常に薄暗い光でのみ開封することをお勧めします。活性が失われた可能性を心配される場合は、小規模のテスト実験を行うことをお勧めします。

いいえ、PMA Enhancerは、グラム陰性菌のみを対象とする場合にのみ使用する必要があります。PMA Enhancerは、グラム陽性菌に悪影響を及ぼします。

Biotium社は、PMAxx™とPMAをdsDNAに光で架橋するためのPMA-Lite™ LED Photolysis Device(品番E90002)を提供しています。PMA-Lite™は、マイクロチューブに入ったサンプル用に設計されています。

PMA-LiteのLEDは、600〜800ミリカンデラ（mcd）の明るさを持っています。各チューブの横には3つのLEDがあり（底面1つ、側面2つ）、波長は465-475nmです。

PMA-Lite™の各チューブ位置は、3つのLED電球で照らされています。位置変動はテストしていませんが、位置や装置によって照明が若干異なる可能性があります。しかし、各ポジションの照明は、生存率色素であるEMA、PMA、PMAxx™の核酸への光クロスリンクに必要な照度をはるかに超える明るさであり、変動がvPCR結果に大きく影響することはないはずです。