FAQ : Kingfisher Biotech（KFB）社 製品について

キャリアタンパク質は凍結乾燥タンパク質の溶解の際に添加されるタンパク質で、希釈されたタンパク質の保存、凍結、使用の際の安定性を増加させるために用いられます。

BSAはリコンビナントタンパク質溶解の際に最も適したキャリアタンパク質です。しかしながら、ウシリコンビナントタンパク質にはウマ血清アルブミン（ESA）などのウシ以外のキャリアタンパク質を使用してください。もし、タンパク質をin vitroの細胞培養刺激に用いるならば、リコンビナントタンパク質はBSAやESA溶液に変わる血清や他の適したキャリアタンパク質を含む完全細胞培養培地で直接溶解するのが便利かもしれません。

キャリアタンパク質の終濃度は少なくとも0.1%にするべきです。必要であれば追加のキャリアタンパク質も使用することができます。典型的に、0.1-10% BSA溶液/1×PBSが溶解液として好ましいです。

典型的に、5μgまたは25μgのリコンビナントタンパク質の溶解量は100μLが好ましいです。Kingfisher Biotech社の5μgまたは25μgのバイアルは最大で500μLに溶解することが可能です。100μgのリコンビナントタンパク質の溶解量は1mLが好ましいです。Kingfisher Biotech社の100μgのバイアルは最大で2mLに溶解することが可能です。

リコンビナントタンパク質の濃度は溶解量に依存します。例えば、5μgのリコンビナントタンパク質を100μLのキャリアタンパク質溶液で溶解したら、濃度は5μg/100μLすなわち50μg/mLとなります。

リコンビナントタンパク質の生理活性は製品データシートに記載されています。もし、生理活性がデータシートに記載されていない場合、Kingfisher Biotech社ではそのリコンビナントタンパク質の生理活性を測定している過程です。種特異的なバイオアッセイはKingfisher Biotech社の主なタンパク質に対して典型的に利用可能ではありません。それゆえに、これらのバイオアッセイは、開発される必要があります。Kingfisher Biotech社ではこのテスト期間の間に、リコンビナントタンパク質を入手可能にすることを選択します。

Kingfisher Biotech社では、リコンビナントタンパク質の生理活性は質量のユニット（例：μg）でのみ報告しており、生理活性ユニット（例：Internatinal Units）では報告していません。生理活性のInternational Unitsは特異的な条件下で、特異的なアッセイにより特異的に生理活性を測定し算出する必要があります。生理活性のInternational Unitsはタンパク質とアッセイに依存します。更に、典型的にヒトリコンビナントタンパク質のみこれらのInternatinal Unitsの生理活性に一致する開発された特異的バイオアッセイを持っています。通常、International Unitsの生理活性はヒト以外の種では明確には定義されていません。バイオアッセイが典型的に高い可変の結果をもたらすので、International Unitsによる生理活性の決定もまた大きく変化します。質量は変化しないので、より正確な測定を提供することができます。それゆえに、Kingfisher Biotech社では全てのリコンビナントタンパク質のバイオアッセイの結果を質量のユニットで報告しています。

酵母の発現系はいくつかの利点があり、酵母で生産されたリコンビナントタンパク質は細胞培養を含む多くのアプリケーションにおいて理想的であるいくつかの特長を持ちます。Kingfisher Biotech社の酵母の発現システムは、培地中にリコンビナントタンパク質を分泌します。この分泌は一般的に最初の精製ステップであると考えられます。なぜなら、酵母細胞は本質的に分泌される天然のタンパク質が非常に少ないからです。タンパク質の機能、適切なフォールディング、可溶性の修飾を必要とする多くのタンパク質が存在します。酵母発現システムの他の利点としては、酵母はE.coliのような細菌細胞壁をもっておらず、エンドトキシン（リポサッカロイド）が存在しないことです。酵母は天然にエンドトキシンフリーです。E.coil発現リコンビナントタンパク質は、翻訳語修飾を含みません（E.coliがゴルジ装置を含まないため）。E.coliによって作成されたリコンビナントタンパク質はしばしば封入体を形成します。封入体からの精製は、リコンビナントタンパク質を除くために、それぞれのリフォールディング過程に続く厳しい条件が必要になります。この処理がタンパク質の機能に影響を与える可能性があります。

以下の2つのテーブルをご参照ください。

1. 抗原アフィニティー精製ポリクローナル抗体
   http://www.kingfisherbiotech.com/product/pdf/Reactivity_of_Polyclonal_Antigen-Affinity_Purified_Antibodies.pdf
2. 細胞表面マーカーモノクローナル抗体
   http://www.kingfisherbiotech.com/product/pdf/Reactivity_of_Cell_Surface_Marker_Monoclonal_Antibodies.pdf

Do-It-Yourself ELISA キットは、非標識抗体（キャプチャー抗体）、リコンビナントタンパク質（スタンダード）、ビオチン標識抗体（検出抗体）の単体です。使い切ってしまった場合など各コンポーネントはそれぞれ別に購入することができます。これらの抗体はELISAで提供されるスタンダードと一緒に機能するように示されています。それぞれのコンポーネントについて、データシートに代表的なワーキング濃度が記載されていますので、何回アッセイができるかを決定する助けになります。典型的に、キャプチャー抗体が制限的な試薬です。

例えば、ブタ IFNα1 Do It Your self ELISA （#DYI0724S-003）には以下のものが含まれます。

100 μg ,Anti-Swine IFNα1 ポリクローナル抗体 （PB0445S-100）: ELISAにおけるこの試薬の推奨タイターは、1-5μg/mLです。もし96ウェルプレートの1ウェルあたり100μLコートするならば、96ウェルプレートをコートするために約10mL必要となります。それゆえに、プレートあたり用いるタイターによって10-50μgが必要となります。この試薬で2-10プレートがコートできることを意味します。

5 μg, リコンビナントブタ IFNα1（RP0010S-005） ： 最適なスタンダード濃度はユーザーが決定する必要があります。もし一番濃い濃度のスタンダードを50 ng/mL（0.05 μg/mL）で使用するならば、1プレートあたり0.5 mLのスタンダードが必要となり、スタンダード200アッセイするのに十分な量です。

50 μg, ビオチン化 Anti-Swine IFNα1ポリクローナル抗体 （PBB0451S-050）: ELISAにおけるこの試薬の推奨タイターは、0.1-0.5 μg/ｍＬです。もし検出に96ウェルプレートの1ウェルあたり100μLを使用するならば、96ウェルプレートを検出するのに約10 mLの試薬が必要となります。それゆえに、使用するタイターに応じてELISAあたり1-5μgが必要となります。この試薬が10-50アッセイを検出できることを意味します。

それゆえに、最適な結果に依存し、提供されるコンポーネントで何回アッセイできるかは大きく異なってきます。前述のようにそれぞれのキットコンポーネントは別々に購入することができます。他のコンポーネントに比べ、キャプチャー抗体が最初になくなるので個別に必要となるケースが多いでしょう。

多くのお客様がVetSetを血清、血漿や他のサンプルタイプの検出に使用しています。異なるサンプルタイプを使用するために、アッセイ中のスタンダードとサンプル希釈液の検証が必要になります。最適な希釈は直線的な結果を提供し（例：サンプルが希釈された時と希釈ファクターで補正したときの値が類似する）、80-120%の回収率が得られます（例：既知のスタンダードの量をサンプルタイプに加え、80-120%の回収率を得る）。

サンプル希釈液がサンプルタイプでワークするかどうかを検証するために、直線性と回収率アッセイを行う必要があります。このアッセイは単純に行われます。まず、テストするサンプル希釈液を使用して通常のようにスタンダードを調製します。既知のスタンダードをテストサンプルに添加します。同じ量のスタンダードをテストサンプル希釈液に添加します（100%回収値）。添加していないサンプルもバックグランドレベルとしてテストサンプルから引くため、一緒に行うことを忘れないようにしてください。スタンダードを添加したサンプル、添加していないサンプルの希釈系列を調製（例: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32など）します。最適な回収率はスタンダード添加サンプルの値（スタンダードを添加していないサンプルをバックグラウンドとして差し引く）が、80-120%となることです、また、結果が希釈したものと補正値が類似の値になるべきです。

しばしば、1：4から1：8の4%BSAを含むDPBS（Reagent Diluent）による希釈はサンプルの直線性を成し遂げ、最適な回収率を得ることに十分です。もし最適な結果が結果が4%BSAを含むDPBSで得られなければサンプルの希釈率を上げるか異なるサンプル希釈液の使用が必要かもしれません。他の希釈液は10-50%血清（ウシ胎児血清またはウマ血清など）を含むDPMS（血清が、ELISAと交差反応する目的タンパク質を含んでいない限り）を使用するのが良いでしょう。さらに、DPBSバッファー中のBSAの量を増加させることで直線性や回収率が上がるかもしれません。