FAQ : Enzo Life Sciences (ENZ) 社 PROTEOSTAT®について

PROTEOSTAT® 検出色素は、凝集サイズを識別していません。本色素は幅広いサイズのタンパク質凝集体と結合し、結合すると高いシグナルノイズ比を持ちます。

これらの検出試薬のスペクトルは重ならないため、同一サンプル上で検出可能です。しかし、お客様ご自身での最適化が必要となります。

熱変性から生じるタンパク質凝集のモニタリングに使用できます。本キットではタンパク質の立体構造を壊し、疎水性領域を露出させる必要がありません。そのため、環境感受性色素（訳注：SYPRO® Orange など）を用いた際に生じる、界面活性剤や膜タンパク質、疎水性化合物との相互作用による高バックグラウンドの問題を最小限に抑えます。

本キットは、ある条件下におけるタンパク質の凝集温度の決定、および、タンパク質の安定性を向上させる条件の最適化に使用できます。凝集温度が通常よりも上昇する条件では、タンパク質安定性も高まるためです。 また、バッファー および 賦形剤がタンパク質の安定性に与える影響を検討したり、目的タンパク質との結合により構造的安定性を与えるリガンドまたは薬剤の同定にも使用できます。

全てのサーマルサイクラーに使用可能です。テスト実績があるサイクラーは LightCycler, Qiagen Rotorgene, Applied Biosystems, Biorad CFX96 RTPCR システムです。

PROTEOSTAT® 色素は熱ストレス応答により生じるタンパク質の凝集体を検出します。正確な検出効率はタンパク質によって異なりますが、タンパク質の特性や種などに関わらず、最小限の最適化をするだけでどんなタンパク質にも使用可能です。

本製品には、コントロールとしてβ-ラクトグロブリンが付属されています。サンプルに高い粘性が無い限り、最適に希釈されたサンプルをアッセイに使用することが可能です。テストサンプルの効果的なタンパク質濃度範囲は、1 mg/mL 以下です。上限はございませんが、20 mg/mL 以上の凝集タンパク質を使用する場合には、色素がサチュレートすることもあります。

染色試薬が強い光にさらされた可能性があります。遮光してください。

• Run 開始前からタンパク質が凝集体を形成している可能性があります。別のバッファーや賦形剤を使用してみてください。
• Gain設定が高すぎる可能性があります。多くのサーマルサイクラーは自動的に Gain設定を行います。Gain 設定を手動で行う場合、シグナルがきちんと観察できるようになるまで下げてください。

以下のような可能性が考えられます。

• サンプル中に 2種類のタンパク質が存在している。
• 測定するタンパク質の他に、賦形剤としてサンプル中に含まれる BSA のピークが検出されている。
• 測定するタンパク質に 2つのドメインが存在し、それぞれが異なる温度で凝集している。

測定するタンパク質は異なる温度で凝集し始める複数のドメインを含むかもしれません。ほとんどのサンプルにおいて、どのような凝集も潜在的な問題の兆候ですので、低い温度のピークが最も重要です。

同一タンパク質が異なる温度で凝集し、別の立体構造体を持つ可能性があります。測定サンプルには、全長タンパク質とその断片が混在していることがあるため、そのサンプルの不均一性により、このような可能性が考えられます。また、測定サンプル中に微量のBSAが含有している場合には、複数のピークが検出されるかもしれません。

β-ラクトグロブリン溶液を調製する際、以下の点に注意しなければなりません。

1. β-ラクトグロブリンコントロールは凍結乾燥した粉末 (16 mg) での提供です。使用する直前に 500 µL の1×アッセイバッファーで溶解し、32 mg/mL のストック溶液を調製してください。
   • β-ラクトグロブリンを溶液中で穏やかに混合し、再懸濁してください。タンパク質を完全に再懸濁させるために、20分程度ローテーターで溶液を混合します。未溶解物を分離して沈殿させるために、最速スピードで約30秒間遠心することをお薦めします。
   • ボルテックスの使用は避け、泡立たせないようにしてください。
   • β-ラクトグロブリンコントロールを再懸濁後は、可能な限りすぐにアッセイに使用することをお薦めします。
   • 未使用のβ-ラクトグロブリン溶液は4℃で保存し、一カ月以内にご使用いただくことを推奨します。凍結により変性することがありますので、凍結保存は避けててください。
   • どうしても長期保存が必要な場合には、少量で分注し-20℃保存してください。そして一度融解したものは使い切り、余りの溶液は廃棄してください。
2. アッセイには、β-ラクトグロブリン溶液が最終濃度 16 mg/mL となるようにご使用ください。使用するタンパク質にもよりますが、ほとんどのアッセイでタンパク質濃度は 1〜16 mg/mL です。理想的には濃度は 1 mg/mL 前後が望ましいです。20 mg/mL 以上の凝集体は蛍光色素がサチュレートすることがありますので、ご注意ください。
   • グリセールような賦形剤の添加や、異なるバッファー組成、異なるタンパク質濃度での測定は凝集温度に影響することがありますのでご注意ください。

本製品は幅広い温度やpH、イオン強度で使用可能で、一般的に使用されるバッファーや賦形剤などにも適応しています。蛍光色素ベースのスクリーニング法を用いることで、従来の計装集約的な分析方法に比べ、処理数の増加による時間の節約、少量サンプルでの検出が可能です。

Nile Red,や SYPRO® Orange, 1,8-ANS は、新たに露出した疎水性表面と色素との相互作用による、タンパク質のアンフォールディングを検出します。これらの色素は周囲環境の疎水性に敏感です。そのため、タンパク質凝集検出時の特異性が低く、疎水性化合物の影響も受けやすい傾向があります。

Thermofluor 技術では、環境感受性色素である SYPRO® Orange を用いて温度上昇に伴うタンパク質のアンフォールディングを測定します。SYPRO® Orange は融解タンパク質へと分配されるため、温度上昇に伴い蛍光が増加します。この方法では、熱アンフォールディング曲線の中間点の温度をTm値 (融解温度) として見積もります。アンフォールディングは隣接タンパク質に非依存的で、タンパク質がアンフォールドしはじめる時、SYPRO® Orange は先行してタンパク質に結合し、くさび効果として知られる現象によって更なるアンフォールドを引き起こします。

一方、PROTEOSTAT® 熱安定性アッセイキットでは、凝集タンパク質の四次構造に結合する分子ローター色素を使用しており、タンパク質はアンフォールディングにつづいて凝集していきます。凝集は隣接するタンパク質に依存し、タンパク質濃度が高いほど凝集する傾向も高くなります。SYPRO® Orange 色素が Tm値を測定するのに対し、PROTEOSTAT® 色素は、熱凝集カーブの中間点の温度である Tagg（凝集温度）を測定します。そのためこの方法では、蛍光強度値の増加が凝集タンパク質の量に直接比例します。

これら2つの製品の検出試薬は類似していますが、同一品ではありません。これらの色素はそれぞれの使用目的に合わせて開発・最適化されています。

●タンパク質凝集測定アッセイキットの色素:
凝集ターゲットを広範囲に測定できるように、µM 以下の凝集も検出できる高感度な色素です。この色素は広範囲な線形ダイナミックレンジ (少なくとも二桁)を持ち、最適なスタンダードセットともにタンパク質凝集形成の定量分析に使用することができます。
●熱安定性アッセイキットの色素:
標準的な水性条件下で最小限の蛍光を発します。温度シフト中に形成される凝集タンパク質の表面に色素が結合すると、赤色の強い蛍光を発しそれを測定することができます。この色素はシャープな変化能を有し、IgG やリゾチーム、T7ポリメラーゼ、炭酸脱水酵素, バクテリアロドプシン、βラクトグロブリンにて評価されています。

理論的にはどちらの試薬も代替可能ですが、条件検討が必要となります。

PROTEOSTAT® 色素は 0.1％ Tween 20 のような界面活性剤に適応性がありますが、使用するタンパク質によって異なります。検証済みの界面活性剤濃度の情報については、マニュアルの表をご参照ください。

残念ながらメーカーではこれらの製品を膜タンパク質で使用した実績はございません。数種類の界面活性剤で処理したタンパク質でテストしたことはありますが、その結果はタンパク質によって異なります。しかしながら、低濃度 (<0.1%) の界面活性剤であれば大抵のタンパク質で使用可能と考えられます。

本色素では〜50 µm の顕微鏡レベルのから、 1 mm の可視レベルのサイズまで検出します。

界面活性剤は高バックグラウンドの原因となることがあるため、細胞ライセートでの使用には検証が必要です。 細胞からのタンパク質抽出に必要な界面活性剤量を滴定してください。大きな凝集は不溶性のため遠心にて沈殿させることができ、小さな凝集は限外ろ過によって分離できます。界面活性剤や膜、可溶性タンパク質を洗い流すことで、残ったタンパク質にPROTEOSTAT® アグリソーム検出試薬をご使用いただけます。

色素の励起及び吸収スペクトルはキットマニュアルの8ページに掲載されています。本色素のスペクトルはFITCとわずかに重なりあうことが示されています。しかしnarrowカットオフ状態で488nm の励起フィルターと515nmの吸収フィルターを使用することにより、本色素と一緒に使用することができます。これは、FITCの蛍光が明るい場合に使用可能です。 それ以外の波長のフィルターを使用する場合には、ProteoStat® 色素の赤色蛍光からFITCフィルターに蛍光被りが生じるかもしれません。FITC標識抗体なしのコントロールをご用意いただくことで、Proteostat®からの蛍光の漏れ込み（蛍光被り）の量について知ることができます。FITCの代わりとして、Cy5標識抗体（と恐らくクマリン標識抗体）の使用をご検討ください。

ポジティブコントロールとして MG132 処理をした細胞を使用することが良いと考えられます。未処理のネガティブコントロールのシグナルと比較し、バックグラウンドのノイズを決定することができます。

トリプシンをご使用いただけます。細胞を溶解後、透過処理のために界面活性剤を加えます。大きな凝集は不溶性なので遠心により沈殿することができ、小さい凝集は限外ろ過によって分離できます。界面活性剤や膜、可溶性タンパク質を洗い流すことで、残ったタンパク質に PROTEOSTAT® アグリソーム検出試薬をご使用いただけます。

膜画分が分離している場合には、測定可能と考えられます。しかし、膜画分が取り除かれていない場合には、膜に色素が捕らわれて、高バックグラウンドの原因になります。

グラム陰性菌の外膜にある LPS が問題となる可能性があります。マニュアルに記載された透過バッファーを使用することで、ほとんどの細菌の内膜を除去し、グラム陰性菌の外膜を破壊することができるため、グラム陰性菌中の凝集体や封入体を視覚化可能です。

色素を添加する前に操作をストップすることお薦めします。色素の蛍光強度は溶液中で経時的に減少します。また色素を長時間タンパク質とインキュベートすると、凝集に影響を及ぼすでしょう。

凝集のパーセント(総タンパク質量に対する凝集割合)は変わりません。しかしながら、凝集タンパク質の濃度は減少しますので、シグナルも減少します。凝集していないタンパク質と共にサンプルを希釈する場合には、凝集タンパク質のパーセンテージは変わります。

PROTEOSTAT® 色素は分子ローター色素の一種です。プローブの中心の C-C単結合は、プローブの芳香族部分を分離している場所ですが、ここを中心にして自由回転しているため、溶液中では本色素は発光しません。(訳注：下図はPROTEOSTAT® 色素の原型のチオフラビンですが、同様の構造をしています。） 分子ローター色素がタンパク質凝集に遭遇すると、βシートを持つフィブリルに固定され、強い蛍光を発します。これは、核酸の塩基間でのエチジウムブロマイドのインターカレーションの際の蛍光強化と類似しています。

PROTEOSTAT® タンパク質凝集測定アッセイキットは、溶液中のペプチド および タンパク質凝集を検出する簡便で均質なアッセイフォーマットです。タンパク質保存の最適な処方の決定、タンパク質凝集の促進剤 および 抑制剤のスクリーニング、分子シャペロン活性の測定に使用されます。スタンダードセットもしくは既知の濃度のサンプルと一緒に用いることで、タンパク質凝集量の決定に使用することも可能です。

PROTEOSTAT® 熱安定性アッセイキットは、タンパク質アンフォールディングによって露出する疎水性領域の検出をすることなく、熱変性から生じるタンパク質凝集を直接観察するキットです。このキットは、バッファー および 添加された賦形剤などがタンパク質の全体的な安定性に与える影響を決定したり、ある条件下でのタンパク質の凝集温度を決定するために使用できます。

PROTEOSTAT® アグリソーム検出キット（品番：ENZ-51035)は、生細胞中のアグリソーム および アグリソーム様封入体内の変性カーゴタンパク質を検出するのに最適化されています。PROTEOSTAT® アグリソーム検出キットの色素はアグリソーム形成中の小胞内の変性タンパク質と結合する際に蛍光を発し、フローサイトメトリー および 蛍光顕微鏡で検出できます。

チオフラビンT：PROTEOSTAT® 色素の原型で、凝集タンパクが存在しない状態では単結合を中心に回転しています（赤色矢印）

サンプル中に干渉物質が含まれています。本アッセイは PBS や Tris, HEPS などの一般的なバッファーや、トレハロースやスクロースなどの賦形剤と互換性があります。しかし、高濃度 （例：0.2％）の Tween 20 との互換性はありません。

タンパク質サンプルの濃度が高すぎます。1×アッセイバッファーで更にサンプルを希釈してください。

• 染色した試薬が強い光に晒された可能性があります。サンプルを遮光保存し、染色後すぐにサンプルを解析してください。
• 凝集タンパク質が溶液中に含まれていない可能性があります。遠心時間が長いと凝集体が沈殿することがあります。凝集タンパク質（サンプルもしくはコントロール）を遠心しないでください。

希釈前にインスリンを脱イオン水で再懸濁しなかった可能性があります。キットに添付されている PBEバッファーで希釈する前に、一度脱イオン水で溶解してください。

停止液の添加が不適切だったことが原因だと考えられます。酵素反応と化学反応の両方を終了させるため、停止液をプレインキュベートしてください。

PROTEOSTAT® 色素とタンパク質間の相互作用は非共有結合です。そのため、理論的には可逆的な相互作用ですが、メーカーでテストしたことはありません。