FAQ：Lexogen社 SLAMseq

SLAMseqは、RNAの代謝シーケンスのためのチオール（SH）結合アルキル化法を使用して、同じサンプルから新たに合成されたRNA（新生RNA）と既存のRNAを並行して識別および定量化できる方法です。生化学的な分離を必要とせず、生細胞を用いた実験に簡単に適用できます。

• SLAMseq最新のウェビナー：SLAMSeq Webinars
• ユーザーガイド：SLAMseq User Guide
• 最新の出版物：SLAMSeq publications

一般的には、必要ありません。S4U標識濃度と組み込み率の実験条件がすでに確立している場合、標識実験を行うためにSLAMseq Kinetics Kit - Anabolic Kinetics Module (061.24)、またはSLAMseq Kinetics Kit - Catabolic Kinetics Module (062.24) のみが必要になります。

検証済の細胞での投与条件についてのは、FAQ【05】をご確認ください。

新しい細胞タイプや実験条件を使用する際には、細胞生存率と最適な S4U 標識濃度を評価することを推奨します。検証には、SLAMseq Explorer Kit - Cell Viability Titration Module（059.24）をご使用ください。

また、SLAMseq Explorer Kit - s4U Incorporation Module (060.24) RNA代謝シーケンス実験において、4-thiouridine（S4U）のRNAへの組み込み率を解析するために設計された製品です。このモジュールを使用しHPLC分析することで、新しく合成されたRNAにS4Uがどの程度効果的に組み込まれたかを測定し、S4U標識の効率を評価することが可能です。060.24を使用しない場合、ライブラリのシャローシーケンスでも同様の確認を行うことができます。

新しい細胞タイプや実験条件を使用する際には、実験の2倍の期間を使って細胞生存率とS4U組み込み率を評価することをお勧めします。例えば、S4U標識を6時間行う予定であれば、細胞生存率は12時間の期間で評価してください。

※長期間のラベリング実験 (時間以上) を行う場合は、S4Uを含む培地を 3 時間ごとに交換することをお勧めします。

最短で標識後30分後のサンプルを含むSLAMseq実験を行うことができます。経時的サンプリングにおける標識期間に設定については、以下のSLAMseqの原著論文で確認できます。

Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics
Veronika A Herzog, Brian Reichholf, Tobias Neumann, Philipp Rescheneder, Pooja Bhat, Thomas R Burkard, Wiebke Wlotzka, Arndt von Haeseler, Johannes Zuber & Stefan L Ameres Nature Methods (2017), doi:10.1038/nmeth.4435

検証済の細胞に対する推奨条件について、以下の表をご確認ください。

推奨条件の無い細胞については、事前の文献調査を推奨します。S4U濃度決定に際して、以下の文献もご参照ください。

Metabolic Labeling and Recovery of Nascent RNA to Accurately Quantify mRNA Stability
Joseph Russo, Adam M. Heck, Jeffrey Wilusz, and Carol J. Wilusz Methods. (2017), doi: 10.1016/j.ymeth.2017.02.003

Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine
Erin E. Duffy, Jeremy A. Schofield, Matthew D. Simon WIREs RNA (2018), doi: 10.1002/wrna.1513

長時間のS4U標識実験を行う際には、S4Uを含む新しい培地を3時間ごとに交換することで、細胞へのS4U組み込みが向上します。組み込み率は細胞種によって異なるため、SLAMseq Explorer Kit - S4U Incorporation Moduleを使用して組み込み率を評価するのが最適です。図1は、マウス胚性幹細胞（mESC）を例に、S4Uを含む培地を異なる頻度で交換した場合と、培地交換を行わなかった場合を比較した結果を示しています（図1）。

図：マウス胚性幹細胞（mESC）のS4U組み込み率
培地を3時間、6時間、または8時間ごとに交換した場合を比較した。培地交換を行わなかった細胞では、特に12〜14時間後に組み込み率が低下した。一方で、3時間ごとの培地交換は、時間経過に伴い最も高いS4U組み込み率を示した。

SLAMseqキットのS4Uは細胞培養培地に適合する溶媒を使用しています。SLAMseq Explorer Kit - Cell Viability Titration Module（059.24）を使用して、S4U投与による細胞の生存率への影響を評価できます。

SLAMseq実験で生成されたTotal RNAからRNA-Seqライブラリを作成する際は、QuantSeq 3' mRNA-Seq V2 Library Prep Kit (FWD) with UDI 12 nt（191 - 196）を使用することをお勧めします。以下の論文で、RNA-Seqライブラリ生成に最適であることが示されました。他の逆転写酵素での評価結果についても確認できます。

Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics
Veronika A Herzog, Brian Reichholf, Tobias Neumann, Philipp Rescheneder, Pooja Bhat, Thomas R Burkard, Wiebke Wlotzka, Arndt von Haeseler, Johannes Zuber & Stefan L Ameres Nature Methods (2017), DOI: 10.1038/nmeth.4435

サンプルはC18カラムで分析する必要があります。原則として、ユーザーガイドに記載されているように、Supelco Discovery C18 reverse phase column (サイズ：250 x 46 mm、粒子サイズ：5 mM) の代わりに任意のC18 カラムを使用できます。

使用するカラムオーブン温度は 30 °C、注入量は 100 UL、流量は 500 UL/miinです。これらの設定では、分析時間は約70分です。分析の合間にカラムを洗浄することが重要です。

使用するstandards、移動相溶液、アイソクラティックグラディエントの詳細については、ユーザーガイド (p.16-17) を参照してください。

HPLCの解析から、ウリジンのシグナルは260 nmで、S4Uのシグナルは330 nmで測定できます。S4Uの組み込み率を計算するためには、まずウリジンとS4Uのピークの面積を求め、それぞれのヌクレオチドに対するHPLC解析から得られるモル吸光係数を決定します。

計算の際には、各ヌクレオシドのモル吸光係数でピークの面積を割り、その結果を掛け合わせることで、ウリジンに対してS4Uが置き換えられた割合（組み込み率）を百分率で求めます。

S4Uによるウリジンの置換率（%）は、次の式で表されます：

% U substituted by S4U = (Area4SU,330 nm/ε4SU,330 nm) × (εU,260 nm/AreaU,260 nm) × 100

この式により、ウリジンのうちどれだけがS4Uに置換されたかを定量的に評価することができます。

DNase I処理はオプションです。サンプルをDNase I処理する必要がある場合、熱による不活性化は避けるべきであり、酵素は酸性フェノール／クロロホルム抽出やシリカカラム精製などの他の方法で不活性化する必要があります。SLAMseq Kinetics Kit - Catabolic Kinetics Module (062.24)でキネティクス実験を行う場合のRNAに対するDNase I処理は、修飾ヌクレオチドがより安定するヨード酢酸アミドでのアルキル化後に行うことをお勧めします。

SLAMseq Kinetics Kit - Anabolic Kinetics Module (061.24)とSLAMseq Kinetics Kit - Catabolic Kinetics Module (062.24)どちらの場合も、ヨードアセトアミド（IAA）によるアルキル化反応に1〜5 UGのTotal RNAが必要となります。SLAMseq Kinetics Kit (062.24)には、Total RNAを安定化する試薬と、アルキル化に必要な IAA が含まれています。得られたTotal RNAは精後、ライブラリ調整に使用できます。ライブラリ調整には、QuantSeq 3' mRNA-Seq V2 Library Prep Kit (FWD) with UDI 12 nt（191 - 196）、またはQuantSeq 3'mRNA-Seq V2 Library Prep Kit (REV) with UDI (225)の使用をお勧めします。

SLAMseq実験の理想的なシーケンス深度は、実験条件 (S4U 標識時間、S4U 取り込み率、細胞タイプなど) により異なります。最適なシーケンス深度を決定するには、以下の2段階のテストをお試しください。

1. 最初のテストスクリーニングとして、SLAMseq-QuantSeqライブラリミックスをシーケンスしてください。例えば、レーンミックスの一部としてシーケンスを行います。このスパイクインランでは、低いシーケンス深度（100万から300万リード）を目指しています。この低深度のシーケンスによって、T>C変異のいくつかをこれらのリードの中で検出することを目的としています。この結果に基づいて、これらのライブラリから得られるリードの総数に対する割合を確認することで、各サンプルに必要なカバレッジ（カバー率）のレベルを判断することができます。
2. SLAMseq-QuantSeqライブラリを、必要なシーケンス深度までシーケンスします。その際、テストスクリーニングで得られたリードとcompletion run（追加のシーケンスラン）で得られたリードをプールして使用します。したがって、追加のシーケンスランの目標リード深度から、最初のスパイクインランで得られた余分なシーケンス深度を差し引きます。これは、最初のスパイクインランで得られたデータを考慮に入れ、過剰なシーケンスを避けるためです。この段階的なシーケンスアプローチにより、シーケンス深度が過剰になるリスクを最小限に抑えることができます。

最小読み取り深度として、開始点としてサンプルあたり少なくとも 2,000万リードを推奨します。ただし、理想的な深度は、使用されるタイムポイントによって異なる場合があります。特に、S4U標識時間が短いサンプルが含まれる場合、よりシーケンス深度を深くする必要があります。必要なシーケンス深度を判断するには、上記の通りスパイクインを行うことを強くお勧めします。

SLAMseq法の開発者の出版物（Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics, DOI: 10.1038/nmeth.4435）では以下を推奨しております。 概算値として（マウス胚性幹細胞を用いた実験に基づく）、s4U標識転写産物を効率的に定量するためには、標識時間が長い場合（3時間以上）には1,000万〜2,000万リード、短いパルス標識の場合（3時間未満）には3,000万〜5,000万リード/ライブラリを推奨します。

シングルリード100 -150 bp (SR100-150) でのシーケンスをお勧めします。

はい、SLAMseqはSmall RNA の解析に使用できます。使用実績は以下をご確認ください。

• ショウジョウバエのmiRNA
  Time-Resolved Small RNA Sequencing Unravels the Molecular Principles of MicroRNA Homeostasis Brian Reichholf, Veronika A Herzog, Nina Fasching, Raphael A Manzenreither, Ivica Sowemimo, Stefan L Ameres Mol Cell. (2019), DOI: 10.1016/j.molcel.2019.06.018
• マウスのpiRNA
  Small RNAs Are Trafficked from the Epididymis to Developing Mammalian Sperm Upasna Sharma, Fengyun Sun, Colin C Conine, Brian Reichholf, Shweta Kukreja, Veronika A Herzog, Stefan L Ameres, Oliver J Rando Dev Cell. (2018), DOI: 10.1016/j.devcel.2018.06.023