FAQ: Bethyl Laboratories社抗体を用いたマルチプレックス

mIFには、高品質のIHC検証済み一次抗体、HRP標識二次抗体、チラミド検出用フルオロフォア、およびアッセイで使用するフルオロフォアを分別できる画像処理システムが必要です。

はい可能です。
mIFは、どのような宿主動物種由来の一次抗体でも使え、抗体が同一宿主動物種由来であっても問題ありません。ただし、きちんと検証されたIHC抗体を用いてmIF研究を開始されることが望ましいです。Bethyl社では、広範な一連のIHC検証済み抗体をご用意しています。他社の抗体製品はBethyl社抗体と互換性はありますが、研究者ご自身で検証する必要があります。

最も一般的なmIFサンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPE）です。チラミド検出を利用したmIFでは複数回の熱誘導性エピトープ回復を行うため、FFPEではない組織ではアッセイ中に劣化してしまいがちです。

Bethyl社の抗体は、Akoya Biosciences社のOpal検出システムを用いてmIF用検証を行っています。他のチラミド試薬をご利用の場合は、研究者ご自身で検証していただく必要があります。

mIFプロトコルに基本的な最適化パラメータの概要を記載しています。mIFアプリケーションでの推奨は、アッセイ開発の出発点にあります。独自の組織を用いて、抗体をさらに最適化する必要があります。組織の固定化、エピトープ回復緩衝液、エピトープ回復に使用する機器、および技術的な熟練度の差もmIFアッセイに影響を及ぼします。

染色の順番が抗原検出に影響を与えている可能性があります。エピトープ回復を複数回行うことで分解してしまうエピトープがあります。この場合、染色順の早い段階でこれらのマーカーを認識する抗体を使用する必要があります。Bethyl社にて検証済みのmIFパネルには、初期条件として確立された染色順が記載されています。この染色順は、mIF実験を始める前にご利用の組織を用いてお確かめください。

フルオロフォアの組み合わせは、同一細胞型内で発生するマーカーを染色する場合は慎重に考慮する必要があります。それらマーカーが同じ細胞内部位に局在化する場合は、特に注意が必要です。この場合、スペクトル重複のないフルオロフォアを使用することをお勧めします。

HIERでは蒸し器が多用されているため、Bethyl社でも使用しています。例えば、電子レンジ処理といった方法も使えますが、お客様独自で検証していただく必要があります。

検出可能な標的数は、利用可能なチラミドフルオロフォアや画像処理システムによって変わります。Vectra Polarisを始めとするいくつかのスライドスキャナーでは9色スキャン（８種の免疫染色マーカー + DAPI）を行うことができます。