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細胞の不死化とは?について説明しますApplied Biological Materials(APB)社 細胞の不死化 入門


不死化細胞とは?

生体組織から直接採取した「初代細胞」の難点は、細胞分裂のたびにテロメアが短くなり、わずか数回の細胞周期で細胞が老化して分裂を停止してしまうことです。そのため、長期的なプロジェクトに取り組む場合には、初代細胞を何度も採取して再構築する必要があります。さらに、採取条件が異なるため、細胞のバッチごとに違いがあり、再現性に頭を悩ませることになります。

不死化細胞(細胞株とも呼ばれる)とはテロメアや腫瘍抑制遺伝子が変化した初代細胞のことです。腫瘍抑制遺伝子(p53やRbなど)は、DNA損傷の可能性が高くなったとき(すなわち複数回の細胞周期の後)に、細胞が分裂を停止するようシグナルを送るのに重要です。不死化した細胞の場合、これらの遺伝子がノックダウンされたり、機能が阻害されたりすることで、細胞が無限に分裂し続けることができます。

テロメア
図1.テロメアとは、DNAの反復領域で、染色体の末端に保護用の「キャップ」を形成し、染色体の劣化を防ぐ役割を果たしている。このテロメアは、細胞周期を繰り返すたびに短くなっていき、最終的には細胞が分裂を停止する「老化」へと導かれる。

理想的な不死化細胞は、親組織と同様の遺伝子型と表現型を持つことです。同じ不死化細胞を何十年も使用している研究室もあり、その結果、その細胞株はよく特徴づけられ、長期的なプロジェクトのための一貫したベースラインとなっています。最も古く、最も一般的に使用されているヒト細胞株は、1950年代に子宮頸がんの細胞から樹立されたHeLa細胞株です。

表1.初代細胞、不死化細胞の利点と欠点
  利点 欠点
初代細胞
  • 親組織と同じ染色体数
  • 親組織と同じような生化学的特性を持つ(成長因子やホルモンの分泌など
  • in vivoでの実験モデルとして最適
  • 有限の寿命/限られた細胞分裂回数
  • バッチごとのばらつきがある
  • 培養の維持が難しい。汚染の影響を受けやすい
  • 入手が困難である(ドナーの有無)
不死化細胞
  • 初代細胞と比較して、より早く成長する傾向があり、より高い細胞密度まで成長することができる
  • 均一な細胞タイプ(ほとんどがクローン)である
  • ドナーが同じであるため、バッチ間のばらつきが少ない
  • ほとんどの細胞特性が親細胞から維持される
  • 長期的なプロジェクトにおいて、費用と時間を節約できる
  • in vitroの実験に適している
  • 細胞は培養中に時間をかけて分化することがある
  • in vitroでの細胞の挙動は、in vivoの状況を表さないことがある
  • 表現型や細胞機能が変化する可能性がある

不死化細胞作製のストラテジー

不死化細胞株の作製方法には大きく分けて2つの方法があります。

方法A:テロメラーゼ逆転写酵素タンパク質(TERT)の発現

TERTタンパク質は、テロメラーゼ酵素の触媒サブユニットであり、通常、ほとんどの体細胞では不活性です。この方法では、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)タンパク質をコードするcDNAを、目的の初代細胞に導入し、hTERTを外因的に発現させることで、細胞は老化を避けるために十分なテロメア長を維持することができます。

表2.TERT発現による不死化の利点と欠点
利点 欠点
  • テロメアの長さに最も影響を受ける細胞(ヒトの細胞など)の不死化に効果がある。
  • 癌のような表現型を引き起こす可能性が最も低い。
  • この方法で作製した細胞株は、遺伝子型が安定しており、重要な表現型マーカーを保持している。
  • 特定の細胞種では、方法Bと比較して高い不死化成功率が得られない可能性がある。
  • hTERTの過剰発現は、一部の細胞種(上皮細胞など)では細胞死を誘発することもある。
  • この方法だけでは、不死化を成功させるには不十分な場合がある。

方法B:ウイルス性のオンコジーンの導入

SV40ウイルスのラージT抗原やHPVのE6/E7オンコジーンなどのウイルス性オンコジーンは、がん抑制遺伝子(p53やRbなど)を抑制することで不死化を実現します。この方法は、方法Aよりも早く効果が得られますが、細胞の性質が一部変わる可能性があります。

表3.ウイルス性オンコジーン導入による不死化の利点と欠点
利点 欠点
  • 不死化への最も早いルート。
  • 不死化が困難な初代細胞(例:上皮細胞)に有効。
  • 細胞の性質を変える可能性がある(例:接触阻害の消失、ゲノムの不安定性、細胞周期のチェックポイントの破壊など)。
  • この方法だけでは、不死化を成功させるには不十分な場合がある。

多くの場合、不死化を成功させるためには、方法AとBだけでは十分ではありません。最近の研究では、hTERTをウイルス性の癌遺伝子と共発現させると成功率が高く、遺伝的背景が明確な、より本物に近い正常な細胞モデルが得られることが分かってきています。

正常細胞の典型的な寿命(緑矢印)
図2.正常細胞の典型的な寿命(緑矢印)。
細胞分裂のたびにテロメアは短くなり、最終的には細胞が複製を停止して死滅する「老化」と呼ばれる状態にまで達する。特定の遺伝子を過剰に発現させたり、阻害したりすることで(例えば、p53とRBの経路を破壊する)、テロメアの短縮を抑制/反転させ、細胞が老化に至らずに分裂し続けることが可能となる。

表4:一般的な不死化メカニズム
それぞれのメカニズムでは、図2に示した複製プロセスに関わる主要な遺伝子が破壊されている。一番右の列には、abmの不死化試薬製品で利用可能なものが記載されている。(※ウイルスの種類については、こちらで詳しく説明しています。)
試薬 メカニズム Applied Biological Materials社(APB社)で利用可能な形態
SV40T Antigen Suppresion of p53 and Rb genes Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus
p53 siRNA Knockdown of p53 tumor suppression gene siRNA Lentivirus
Rb siRNA Knockdown of Rb tumor suppression gene siRNA Lentivirus
Ras Suppression of Rb Lentivirus
C-myc T58A Suppression of p53 Lentivirus
Bmi1 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus
CDK4 Suppression of p16/Rb pathway Lentivirus
HPV 16 E6/E7 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus
EBV Viral oncogene -
hTERT Elongation of telomeres Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus
参考文献

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