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バイオ医薬品の安全性/有効性に極めて重要ですLudger社高度にシアル化されたタンパク質の分析


背景

ヒトにおいて、グリカン上の主要なシアル酸はNeu5Acですが、非ヒト細胞株を用いて発現させた場合、Neu5Gcが糖タンパク質に付与されることがあります。この非ヒトNeu5Gcは炎症や、バイオ医薬品の中和(有効性の喪失)といった免疫学的応答を誘発する可能性があります。また、グリカンのシアル化は、薬物動態にも大きな影響を及ぼし得ます。シアル酸を失い、末端にガラクトースが露出した糖タンパク質は、肝臓内のアシアロ糖タンパク質受容体によって血中から除去されることが知られています。例えばEPOは、シアル酸に余分なアセチル化修飾(Neu5,9Ac2)を受けることで、薬効(半減期)に影響が出ます。また、糖鎖のシアル化は、受容体結合およびシグナル伝達にとっても重要であり、例えばIgG Fcのグリカンにシアル酸が存在すると、ADCC(抗体依存性細胞傷害)活性が低下することや、それをマウスに投与すると抗炎症作用があることも知られています。以上のように、バイオ医薬品のシアル化は安全性と有効性に影響を与える可能性があり、規制機関はグリカンのより厳密なキャラクタリゼーションを要求しています。これはバイオ医薬品の品質に関するEMAガイドラインで強調されており、先行バイオ医薬品とバイオシミラーの両方で、広範囲にわたる最先端の特性評価試験が並行して実施されることが求められています(以下参照)。

(“EMA Revises Biosimilars Guideline on Quality Issues”in Hogan Lovells (ed) Focus on Regulation, posted on June 9, 2014 by Elisabethann Wright and Ciara Farrell. )

1. シアル酸の同定と定量

(a)Ludger DMB シアル酸ラベリングキット(品番:LT-KDMB-A1)には、(U)HPLC分析によるNeu5Ac、Neu5Gc、及びNeu5, 9Ac2の放出、同定および相対定量のための試薬が含まれています。DMBタグでシアル酸を特異的に蛍光標識し、(U)HPLCを使用して検出および定量を行います(図1)。このような蛍光タグを使用すると、非標識で検出するHPAEC-PAD法よりも感度が高くなる他、バッファー中の非特異的なピークの検出を抑えることができるという特長があります。
(b) 糖タンパク質上のNeu5Ac及びNeu5Gcの絶対量はLudger定量標準:N-acetylneuraminic acid、N-glycolylneuraminic acid(それぞれの品番:-NEUAC-01、CM-NEUGC-01)との比較によって決定することができます。
(c)グリコペプチドスタンダード(品番:BQ-GPEP-A2G2S2-10U)は、グリカンの放出、標識および回収の効率をチェックするために推奨されており、測定精度の確認が行えます。

RP-HPLC によるDMBラベルされたシアル酸リファレンスパネルの分析
図1. RP-HPLC によるDMBラベルされたシアル酸リファレンスパネルの分析
(リファレンスパネルはLudger DMB シアル酸ラベリングキット(品番:LT-KDMB-A1)に含まれている他、単品(品番:CM-SRP-01)でもご購入可能です。)

2. シアル化グリカンのキャラクタリゼーション

N-グリカンは、PNGase F(品番:E-PNG-01)によってバイオ医薬品から除去されます。グリカンを2AAまたは2ABで蛍光標識後、2-ピコリンボラン還元剤(品番:LT-KAB-VP24、またはLT-KAA-VP24)で処理することで化学的に安定な構造とし、LudgerClean T1 カートリッジ(品番:LC-T1-A6)を用いて精製します。
(a)HILIC-(U)HPLCによる分析はグルコースユニット(GU)値を得ることができます。
(b)エキソグリコシダーゼシーケンシングにより、存在している糖鎖のキャラクタリゼーションを行うことができます(図2)。例えば、シアリダーゼ(品番:E-S001)で消化後に消えた(または減少した)ピークには、シアル化構造が含まれていることがわかります。
(c)LudgerSep-C3 weak anion exchange(WAX)カラムによる電荷による分離は、モノ、ジ、トリ、及びテトラシアル化グリカンの相対比率がわかります(図3)。複雑な混合物の場合、これらの荷電の異なる画分に対して、HILIC-(U)HPLCによるエキソグリコシダーゼシーケンシングを行うことで、糖鎖の構造を同定することができます(図4)。
(d)シアル酸安定化のためのパーメチル化処理後のMALDI分析により、質量組成データを得ることができます(図5)。

EPOのエキソグリコシダーゼシーケンシング
図2. EPOのエキソグリコシダーゼシーケンシング(LudgerSep-N2カラム使用)

Weak anion exchange (WAX)-HPLC、LudgerSep-C3カラムによる2AB標識グリカンの電荷による分離
図3. Weak anion exchange (WAX)-HPLC、LudgerSep-C3カラムによる2AB標識グリカンの電荷による分離
赤:フェチュインのN-グリカン、青:EPOのN-グリカン

WAX-HPLCで分離後の電荷の異なるフラクションを用いて、HILIC-(U)HPLCで解析を行う
図4. WAX-HPLCで分離後の電荷の異なるフラクションを用いて、HILIC-(U)HPLCで解析を行う(EPOのN-グリカン鎖)

パーメチル化したEPOのN-グリカン鎖のMALDI解析
図5. パーメチル化したEPOのN-グリカン鎖のMALDI解析

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