はじめに
細胞や組織を培養する環境は様々な観点でin vivoでの環境とは異なります。中でもin vitroでの重要な要素として、培地、サプリメントなどの添加物、培養容器、培養条件などがあります。ヒトや動物の培養細胞は実験動物に比べ、管理しやすく、再現性が良い系であることから、よく使用されております。
細胞培養プロセス
初代培養と組織培養
動物やヒトから単離され行われる初代培養は、細胞の種類や分化の状態など不均一な集団です。単離するごとに性質はそれぞれ異なっており、完全に再現することは出来ません。分化のプロセスは細胞が組織から分離された瞬間から始まります。従って、初代細胞培養は変化が継続的に起こっている、動的な系といえます。初代培養には通常、動物の血清など明確に定義できない添加物を加えた培地を使用するため、初代培養を確立することがとても困難です。
細胞株
不死化細胞株
不死化した細胞株はin vitroで長期間培養し培養可能で、セルバンク等で凍結保存されているものもあります。初期の表現型の変化は由来組織から分離した後に起こり、株化の過程で安定しています。従って不死化した細胞株はより初代培養細胞に比べて均一で安定性があり、より再現性が高くなります。一方で、分化能を保持していない事や、由来組織のin vivoの性質をあまり示さない場合があるという欠点があります。また細胞株のほとんどは、管理が不十分な状態で世界中で使用されていることが多く、他細胞のコンタミや同定エラーを引き起こす可能性が高くなっています。そのため、ドイツのDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ）や、アメリカのAmerican Type Culture Collection （ATCC）、日本のRiken Gene Bank、UKのEuropean Collection of Animal Cell Cultures （ECACC）等の信頼できる機関から購入することをお勧めします。
有限増殖性細胞株
増殖に限界のある（Finite）細胞株は何回か継代培養出来る能力を持ちますが、最終的には分裂が終了してしまいます。この状態では細胞分裂は止まるものの、細胞自体はまだ生きており、機能的な能力を保持していることもあります。有限増殖性細胞株はin vitroでの寿命の研究に有用です。しかしながら、これらの細胞は決まった分裂回数を超えて使うべきではありません。
幹細胞株
胚性細胞や生殖細胞などの幹細胞株は、幹細胞としての特徴を持ち、多様な細胞への分化能を持つ細胞株です。これらの幹細胞としての特徴を維持するために、培養や凍結保存における細胞の取り扱いには十分な注意が必要です。
CO2インキュベーター
- CO2濃度（5%）
- 湿度（90〜95%）
- 温度（37℃）
- 無菌条件の確保（水、各機器、器材の表面）
- 空気：循環／非循環
フィルター／非フィルター
酸素と二酸化炭素は細胞の生存に必要ですが、これらの存在比は細胞の生育に大きな影響を与えます。両者の濃度が高すぎると細胞には有毒となり、低すぎると細胞の増殖を阻害し、結果的に細胞は死滅してしまいます。酸素濃度はそれぞれの目的ごとに最適に調整する必要があります。また多くの細胞培養では、二酸化炭素の最適な濃度は5%（V/V）とされていますが、しかし最適な二酸化炭素濃度は使用培地、培養する細胞の種類、その他特別な条件等により調整する必要があります。他にも、インキュベーターの扉を繰り返し開閉する事が細胞の生育に影響を与える事があります。
オススメ商品！細胞培養用培地
- 内容：
- 基礎培地
- 血清
- グルタミン
- 抗生物質
In vitroでの研究は複雑な成分を配合した培地が使用されています。細胞培養用の培地は定められた塩分、糖分、アミノ酸やビタミン等を含む基礎培地に、細胞の増殖や分化誘導のために必要な添加剤を加えます。従来からある培養方法として血清の添加や、あるいは細胞の種類によって無血清の培養を必要とする場合があります。
グルタミンは細胞倍地中での安定性に問題があります。4℃以上の溶液中で分子は分解してしまい、有害なアンモニウムが生成してしまいます。従って、グルタミンの保存溶液は凍結して保存する必要があります。グルタミンを含むジペプチドであるアラニルグルタミンは、グルタミンの代替としてとても有用で、室温で保存されても長い時間安定に存在することが出来ます。また、水溶性も高く、熱にも安定です。細胞はペプチド結合を切断し、L-Glutamineを摂取することが出来ます。グルタミンは非酵素的に分解されアンモニアとPyroglutamine（pyrrolidonecarboxylic acid）に培地中で分解されます。
オススメ商品！抗生物質はバクテリアなどの原核生物に対し効果があるものの、同時に動物細胞に対しても毒性を示す可能性がある試薬であることを認識しておく必要があります。抗真菌剤は高いオーダーで真核性の微生物に作用しますが、動物細胞に対してもより強い毒性があります。これらが示すように、抗生物質の使用は以下の2つの場合に限定するべきです。
a）コンタミネーションから組織や臓器、初代培養細胞、細胞株などを守る
b）抗生物質への耐性遺伝子の発現よるリコンビナント細胞のポジティブセレクション
Table 1参照
| 品名 | 品番 | 活性 | 対象 | 推奨濃度 |
|---|---|---|---|---|
| Amphotericin B (Fungizone) solution | 03-028-1 | 真菌類の膜にあるステロールと結合し、膜の浸透性に影響を与える | Fungi (Yeasts, Molds) | 1-10mL/L |
| Amphotericin B (Fungizone) solution | 03-029-1 | Fungi (Yeasts, Molds) | 0.1-1mL/L | |
| Nystatin* suspention | 03-030-1 | Fungi (Yeasts, Molds) | 1-10mL/L | |
| Penicillin-Streptomycin solution | 03-031-1 | ペニシリン：バクテリアの細胞壁を合成する際の最終段階を阻害 ストレプトマイシン：バクテリアの30sリポソームに結合し翻訳に影響を与える |
Gram＋ Bacteria Gram− Bacteria |
10mL/L |
| Penicillin-Streptomycin solution, 10x | 03-031-5 | Gram＋ Bacteria Gram− Bacteria |
1mL/L | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin mixture | 03-032-1 | ペニシリン、ストレプトマイシン：03-031-1参照 ナイスタチン：03-030-1参照 |
Gram＋ Bacteria Gram− Bacteria Fungi (Yeasts, Molds) |
10mL/L |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B solution | 03-033-1 | ペニシリン、ストレプトマイシン：03-031-1参照 アムホテリシンB：03-028-1参照 |
Gram＋ Bacteria Gram− Bacteria Fungi (Yeasts, Molds) |
10mL/L |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin solution | 03-034-1 | ペニシリン：03-031-1参照 ネオマイシン：バクテリアの30sリポソームに結合し翻訳に影響を与える |
Gram＋ Bacteria Gram− Bacteria |
10mL/L |
| Gentamicin sulfate solution | 03-035-1 | バクテリアの30sリポソームに結合し、翻訳に影響を与える | Gram＋ Bacteria Gram− Bacteria |
1mL/L |
| Kanamycin sulfate solution | 03-049-1 | Gram＋ Bacteria Gram− Bacteria | 10mL/L |
■Classical media
- MEM (Hanks', Earle's)
- DMEM (HG, LG)
- RPMI (with glutamine, w/o glutamine, with HEPES)
- Nutrient mixture Hams' F10
- Nutrient mixture Hams' F12
- M199 (Hanks', Earle's)
Minimum Essential Medium（MEM）のように、同じ培地名でも組成が少し違う培地が多く存在しています。培地の組成がほんの少し違うだけでも、ある細胞や組織の特徴を大きく変えてしまいます。多くの場合ではこれらのバリエーショ ンは特定の目的のために開発されたものです。従って使用するべき培地は厳密に調査する必要があります。
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|---|
| Biological Industries社のホームページで全ての基礎培地の組成を公開しています。 |
■基礎組成：
- 水
- 塩分
- アミノ酸
- 糖分
- ビタミン
- フェノールレッド
- バッファー、抗酸化剤、微量元素、脂質
■バッファー
バッファーは培地中の酸や塩基が増減した際に、緩衝作用によりpHを一定濃度を保ちます。
■様々なバッファー系：
- NaHCO3/CO2
- リン酸
- HEPES
- MOPS, Tricine
炭酸塩/二酸化炭素（NaHCO3/CO2）バッファー系
培地中の二酸化炭素は酸性状態を生成します。二酸化炭素は水と可逆的に反応し、炭酸を形成しH+イオンとHCO3−イオンを放出します。
H2O + CO2 ⇔ H2CO3 ⇔ H+ + HCO3−
NaHCO3 ⇔ Na+ + HCO3−
| DMEM | MEM |
|---|---|
| 3.7g/L炭酸水素ナトリウム | 2.2g/L炭酸水素ナトリウム |
| 10% CO2 | 5% CO2 |
| Hanks | Earles |
|---|---|
| 350mg/L炭酸水素ナトリウム | 2,200mg/L炭酸水素ナトリウム |
| 閉鎖系 炭酸水素ナトリウムは栄養素として使われています。 |
開放系 緩衝作用のために、多量の炭酸水素ナトリウムを使用します。 |
もし、インキュベーターが5%CO2に調整され、高い濃度の炭酸ナトリウムが培地に含まれている場合は、pHを合わせるため、細胞を培養する前に培地を15-30分インキュベーター内に静置しておくことをお勧めします。
HEPESバッファー
HEPESバッファーは大気条件下、開放系容器での使用を目的としたバッファーです。HEPES（N'-2 Hydroxyet hylpiperazine-N'-2 ethanesulphonic acid）は両性イオンとして作用します。デリケートな細胞を用いる場合は、HEPESバッファー培地をお勧めします。HEPESバッファー培地はその組成と共に炭酸ナトリウムを含みます。HEPESバッファー培地では、元となる培地の浸透圧を維持するために、塩化ナトリウムの濃度を減らしています。HEPESは優れた緩衝能力により、培地をｐH7.2-7.6で安定化させます。これにより、急速な細胞増殖により急激に酸性に傾くような細胞の代謝変化に対して、より耐性を持たせることが出来ます。
| RPMI 1640 Medium （品番：01-100-1） | RPMI 1640 Medium with 25mM HEPES （品番：01-106-1） |
|---|---|
| NaCl：6.0g/L | NaCl：5.5g/L |
| 浸透圧：269-296 mOsm/kg | |
| DMEM/F12 (1：1)classical medium (品番：1-170-1) | DMEM+F12 (1：1) |
|---|---|
| 炭酸水素ナトリウム：1,200mg/L | 炭酸水素ナトリウム：2,438mg/L |
| HEPES：15 mM | HEPES不含 |
■浸透圧
※重要ポイント！
9g/L 塩化ナトリウム（生理食塩水） → 290 mOsm/kg
1g/L 塩化ナトリウム → 32 mOsm/kg
■pH
細胞培養の至適pHは、哺乳細胞ではpH7.2-7.4、昆虫細胞ではpH6.0と考えられています。わずかなpHの変化でも、細胞の表現型や増殖、生存率に大きな影響を与える可能性があります。
■フェノールレッド
フェノールレッドは中性から酸性へのわずかなpH変化をいち早く知るためのpH指示薬です。色が変化した場合は培地のpHが変化していますので、コンタミネーションが起こっていなくとも培地を交換する必要があります（通常は培地が完全にオレンジ色に変わる前に交換する必要があります）。
注意：フェノールレッドにはエストロゲン様の作用があるため、エストロゲン作用を評価するような細胞実験には使用できません。
| Phenol Redの色の変化 | ||
| below pH 6.6 | ⇔ | above pH 8.0 |
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■品質管理 ■貯蔵条件 ■培地の種類： ■培地の製造方法： ■カスタム製造 |
無血清培地（SFM）
■血清の問題点
- ウィルス等のコンタミネーション
- 成分が不明確
- ロット間で品質が異なる
- 価格の変動
- 原材料の入手が限られる
世界的な原材料不足からFBS（fetal bovine serum）の価格が不安定になってきており、血清を含まない培地組成の開発が進んできています。FBSは各ロットで評価する必要があります。また、FBSを生物由来製品の生産に用いた場合、FBS成分を後の過程で精製除去する事が困難です。
■無血清培地は基本成分として下記を含みます
- アルブミン Albumin
- インスリン Insulin
- トランスフェリン Transferrin
- セレニウム Selenium
■動物成分不含（ACF）/ 無血清（SFM）培地の成分
● ヒト由来の精製タンパク質あるいはリコンビナントタンパク質
● ACF / SFM with no proteins
通常の無血清培地は血清を含みませんが、動物由来の成分を含む場合があります（例 ウシ由来のアルブミン）。ACF培地は通常、組換え蛋白質を含みますが動物由来の精製タンパク質（例 ヒト血清アルブミン：HSA）は含みません。
血清
血清は基礎培地へのサプリメントとしてよく使われます。細胞培養として最も良く知られているのがウシ胎仔血清（Fetal Bovine Serum:FBS あるいは Fetal Calf Serum:FCS）です。細胞培養では、血清はホルモンや接着分子などの、細胞の成長に必要な様々なタンパク質成分や低分子量の栄養素、不溶性成分を水溶性にする運搬体などを供給します。血清はまた、緩衝液としての能力や毒性物質を中和する能力も持ち合わせています。良く用いられる血清は下記のとおりです。
- ウシ血清
・牛胎仔血清（FBS、FCS）
・牛新生仔血清（10日未満）（New Born Calf Serum:NBCS）
・仔牛血清
・成牛血清 - ウマ血清
- ブタ血清
- ウサギ血清
- ヤギ血清
- ヒト血清
■血清 & 血漿
血清は凝血後の液体成分を指します。従って、フィブリノーゲンなどの凝固因子を欠いています。血漿は血液から血球を除いた液体部分で、抗凝固剤で処理された液体です。
■FBSの原材料
世界市場には主に2種類のグレードのFBSがあります：USDAグレードFBSとヨーロピアングレードのFBSです。USDA-グレードとは、BSE（Bovine Spongiform Encephalopathy）及びFMD（Foot and Mouth Disease）が無いことが証明されている国からの原料のみを用いて製造されます。BLG社のFBSは全てUSDAグレードです。
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■血清製品 透析済血清 非動化血清 チャコール処理済 FBS ヒトES細胞（胚性幹細胞）テスト済血清 間葉系幹細胞（MSC）培養用FBS Tet-On® Tet-Off® 血清 ■品質管理 ■物理的、化学的検査 ■微生物学的検査 ■性能検査（細胞増殖） ■安定性 Stability ■FAQs |
細胞剥離溶液
ほとんどの培養細胞では、1層の細胞層あるいは培養基材にシート状に結合した状態で増殖します。
接着細胞を継代する際はこれらの細胞間の結合は緩やかに剥離しなければなりません。トリプシンのようなタンパク質分解酵素は、緩やかにこれらの結合を切断し、個々の細胞を培養器材から剥離させます。下記は細胞を剥離するための溶液です：
● クルード トリプシン（キモトリプシン、エラスターゼ）
● 結晶化 トリプシン
● 非酵素（キレート）
● 植物酵素（パパイン、フィシン）
クルード トリプシン
クルード（粗）トリプシンは接着細胞を継代する際に、細胞を剥離するために使われます。ただし、トリプシン処理が長くなりすぎると継代に問題を引き起こすことがあります。クルードトリプシンを使うにあたっては3-5分以上、細胞をさらさないようにしなければなりません。細胞に大きなダメージを与えてしまう可能性があります。また、細胞を溶液層が無い状態に置かないようにしてください。
結晶化 トリプシン
結晶化トリプシンの使用により、クルードトリプシンに比べ、より長い期間無血清培地における細胞増殖が可能となります。これはより緩やかに、細胞の生存にとってより良い状態になるように、特別に調整したものです（大豆トリプシン阻害剤により完全に中和されます）。
非酵素 細胞剥離溶液
接着性の細胞を培養容器から緩やかに剥離するために調整した非酵素性の溶液です。機能的に生存している細胞を出来るだけ多く得るために調整されています。また、この溶液はタンパク質、動物由来成分不含です。その他の主な利点としては、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で起こるような問題が無く、より長い時間細胞を処理することができます。しかし、強い接着性の細胞にはお勧めできません。このような剥離が難しい細胞にはパパイン細胞剥離溶液がお勧めです。
パパイン細胞剥離溶液
パパインは広い特異性で多くのタンパク質基質を分解し、組織や細胞に対して悪影響が少ないだけでなく、他のタンパク質分解酵素よりも効率が高いことが知られています。トリプシンの代替としてご使用いただけます。
低温保存
低温保存は−196℃の低温に細胞や組織を冷却することで保存する方法です。このように低い温度では細胞を死に導くような反応を含めて、殆どの生物的な活動が効果的に停止します。通常は血清を含む培地が使われますが、無血清培地を用いている場合、凍結保存も血清を含まない培地を用いる必要があります。Biological Industries社が開発した細胞保存液はメチルセルロースとDMSO以外に血清やタンパク質そのた動物由来のタンパク質を含みません。凍結融解後の細胞生存率が高く、細胞の成長と接着性能を保持します。実際、血清を含有した凍結培地と比較しても、高い生存率と接着性能を示しました。従いまして、この血清不含の凍結培地は血清を含む培地で培養している場合でもお勧めできます。
凍結保存前にマイコプラズマの検査をしておくことをお勧めいたします。
■マイコプラズマの混入
細胞株を使用した研究において、マイコプラズマの混入は大きな問題です。多くの場合、顕微鏡での観察での視覚的な検出は出来ません。マイコプラズマは細胞の生命維持に対する影響を与えませんが、細胞の代謝や成長、タンパク質合成、サイトカイン分泌に影響し、また、DNAやRNAに対しても障害を与えます。従って、マイコプラズマが存在する場合に得られた実験結果は偏った結果となることがあります。
PCRは培養細胞中に混入したマイコプラズマを高感度、特異的かつ、迅速に検出する方法として知られています。特異的なプライマーはリボソームRNA（16SrRNA）をコードするDNAから設計されています。そのRNAに対する遺伝子配列は良く保存された配列で、多くのマイコプラズマで類似しています。その結果、マイコプラズマに特異的で、他のバクテリアや動物のDNAを検出することなく、特異的に働きます。
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■マイコプラズマに感染した細胞での抗生物質による処理 ■マイコプラズマ混入細胞で使用する抗生物質 商品 |
