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コンタミネーションの種類とその対策について説明しますApplied Biological Materials(APB)社 細胞培養の品質管理とコンタミネーション


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細胞培養は、実験の環境が無菌状態に保たれていない場合、非常に汚染されやすいものです。 コンタミネーションを早期に発見するための最善の方法は、日常的に顕微鏡で細胞培養をチェックし、細胞が通常どのように見えるかを熟知しておくことです。 以下の情報は、サンプルのコンタミネーションの可能性を減らすために役立つヒントになります。

【目次】

  1. バクテリア、カビ、微生物のコンタミネーション
  2. マイコプラズマのコンタミネーション
  3. 細胞株のクロスコンタミネーション (STRプロファイリングと種の同定)
  4. ウイルス、病原体のコンタミネーション

バクテリア、カビ、微生物のコンタミネーション

細菌や真菌は、物質の表面、空気中、水中など、私たちの身の回りに存在しています。特に真菌類の多くの種は、非滅菌の水に存在するだけでなく、真菌の繊維がカビと呼ばれるコロニーを形成すると、空気中でも容易に拡散します。また、マイクロピペット、ピペットチップボックス、ファルコンチューブなどの非滅菌機器をバイオセーフティーキャビネットに持ち込むと、簡単に汚染がもたらされます。

培養物に微生物汚染の兆候が見られた場合は、近隣の培養物や近くの機器に広がらないように、汚染された培養物を直ちに除去してください。

どんなことに気をつければいいですか?

培養した細胞の画像を頻繁に撮り、詳細な観察結果を実験ノートに記入するのが良い方法です。細胞に変化があった場合には、そのノートを参照することができます。光学顕微鏡では、以下の項目を定期的に確認することができます。

  • バクテリアのコロニーや菌類によって培地が濁っている
  • 細胞形態の変化
  • 接着していた細胞が突然剥離したり、細胞が死滅したりした。

顕微鏡で見える黒い点は何ですか?

培養物の中に黒い点が見えることがよくあります。培養液中のこれらの黒い点は、コンタミネーションと勘違いされやすいのですが、単なる細胞の破片(セルデブリ)である場合もあります。一般的な細胞株と比べて、多くのデブリを培地中に放出する細胞株もあります。また、培養液中にアポトーシスを起こした細胞や不健康な細胞が多く含まれている場合は、より多くのデブリが見られることがあります。

コンタミネーションと細胞の破片を区別するには、より高い倍率で細胞を見て、黒い点がどのように動くかを観察ください。

セルデブリ:培地の動きに合わせて動く黒い点。

細菌・真菌のコンタミネーション:培地の動きとは無関係に動く黒い点。細菌や真菌の中には、培地の中を移動するための繊毛や鞭毛を持っている種があるため、振動や円運動のような動きをすることもあります。

細菌の混入を防ぐにはどうしたらいいですか?

一般的な方法の一つとして、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を〜0.5〜1.0%で完全培地に加えることがあります。ほとんどの細胞株はこれらの抗生物質に感受性がありませんが、例外もあります。適切な増殖条件を確保するために、ご使用の細胞株に推奨される培養プロトコールにお従いください。

細胞株の抗生物質感受性を調べるには、ペニシリン/ストレプトマイシンを含む培地と含まない培地での細胞の増殖を比較します。2つの条件で細胞の増殖に違いがなければ、ペニシリン/ストレプトマイシンを使用することができます。

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図1.バクテリア汚染のある場合とない場合の培養細胞の例
A. 10倍に拡大したバクテリア汚染。
B. 20倍に拡大したバクテリア汚染。黒い点が非常に目立つ。
C. 10倍に拡大して見た付着上皮細胞。付着した細胞の間には、細菌や真菌の混入を示唆する黒点は見られず、細胞はその種類に応じて適切な形態をしている。

Applied Biological Materials社 (APB社)のBacAway (品番:G285) は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を標的とする抗生物質です。また、Amphotericin B (Fungizone, 品番:G274)は、アンフォテリシンBとデオキシコール酸からなる抗真菌剤です。

マイコプラズマのコンタミネーション

マイコプラズマ (細菌の一種) は、細胞培養において極めて一般的なコンタミネーションの原因でありながら、肉眼はもちろん、光学顕微鏡でも検出することができません。マイコプラズマは0.2〜0.3µmと非常に小さいため、濁りやpHの変化を起こすことなく、細胞培養液中に高濃度で存在することができます。マイコプラズマのサイズはフィルターの孔を通過できるほど小さいので、培地をろ過してもマイコプラズマの汚染を防ぐことはできません。

なぜマイコプラズマは問題なのですか?

マイコプラズマは、細胞の行動のほぼすべての要因に影響を与え、以下を引き起こす可能性があります。

  • 栄養素の枯渇や有害な代謝産物の分泌による増殖の阻害
  • 免疫学的反応
  • ウイルスの増殖やウイルス感染率への影響
  • 染色体異常の発生
  • マイクロアレイや遺伝子発現プロファイルの変化
  • 細胞トランスフェクション率の低下
  • DNAやタンパク質の分離ワークフローへの干渉

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図2.3T3細胞の培養液にマイコプラズマが存在しない場合(A)と存在する場合(B)

マイコプラズマがコンタミネーションしているかどうかは、どうすればわかりますか?

マイコプラズマは、湿った状態でも乾燥した状態でも生存することができるため、ある培養物から別の培養物へ容易に移ることができます。マイコプラズマのコンタミネーションを検出するには、以下のような方法があります。

  • 組織学的染色
  • 酵素活性測定
  • ELISAまたは蛍光検出
  • DNA染色 (DAPIまたはHoechst 33258)
  • PCRによるマイコプラズマDNAの増幅

上記の方法のほとんどは、時間がかかり、特殊な装置を必要とします。我々は、最も迅速で簡単なマイコプラズマの検出方法としてPCR法を推奨します。この方法では、細胞培養サンプル中のマイコプラズマDNAを増幅させ、ポジティブコントロールと比較します。

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図3.マイコプラズマのPCRによるチェック
APB社のPCR Mycoplasma Detection Kit (品番:G238) を用いて検査した細胞培養物からの増幅産物を1%電気泳動アガロースゲルで測定した。
レーン1はネガティブコントロール、レーン2〜23は細胞培養サンプル、レーン24はポジティブコントロール。

Applied Biological Materials社 (APB社)のMycoplasma PCR Detection Kit (品番:G238) は、細胞培養上清から直接マイコプラズマDNAを増幅し、200種以上のマイコプラズマをわずか2時間で検出することができます。

マイコプラズマに汚染された細胞を救済することはできますか?

マイコプラズマとの戦いでは、ペニシリンやストレプトマイシンは効果がありません。マイコプラズマ汚染が確認された細胞株は、残りの培養細胞への汚染拡大を防ぐため、できるだけ早く細胞を廃棄してください。また、以下の方法の1つまたはすべてを用いて、培地や機器を洗浄するとよいでしょう。

  • オートクレーブ処理
  • 洗剤の使用
  • ろ過

細胞株が重要で廃棄できない場合は、テトラサイクリン、マクロライド、キノロンなどのマイコプラズマに有効な抗生物質を含む化学処理を行うことが、最も簡単な汚染除去の方法です。場合によっては、マイコプラズマの株が抗生物質のカクテルに耐性を持つことがあり、その場合には、効果のある抗生物質の混合物を見つけるために試行錯誤する必要があります。

細胞の種類によっては、抗生物質が害を及ぼす可能性があるため、抗生物質のカクテルを希釈する必要があります。マイコプラズマの除去によく使われる希釈液は、汚染の強さに応じて1:500、1:1000、1:10,000です。マイコプラズマの除去には、数週間から数ヶ月かかることが多いことを覚えておいてください。

Applied Biological Materials社 (APB社)のMycoplasma Elimination Cocktail (品番:G398) は、ほとんどの哺乳類細胞株に対して非毒性であり、培養中の培地に直接添加することで、わずか4継代(2週間)でマイコプラズマを除去することができます。

細胞株のクロスコンタミネーション (STRプロファイリングと種の同定)

なぜ細胞培養のクロスコンタミネーション (交差汚染) をチェックすることが重要なのですか?

細胞培養に基づく研究の増加に伴い、細胞株間のクロスコンタミネーションは細胞培養作業において大きな問題となっています。2003年に発表された論文によると、交差汚染は16〜35%の割合で発生しており、その中でもHeLa細胞株の他の細胞株へのコンタミネーションが最も多く、当時報告された90以上の細胞株が汚染されていたと報告されています。HeLa細胞株は、他の細胞株に比べて早く、強固に成長するため、他の培養培養を圧倒します。

クロスコンタミネーションは、無菌操作が適切に行われなかった場合に発生し、不正確な科学的結論を導くことになります。このため、ジャーナルの承認や助成金を得るために論文を提出する研究者は、承認を得る前に論文に含まれる細胞株を認証(authentication)する必要があります。認証の結果、クロスコンタミネーションがあった場合、研究結果は無効となります。

STRプロファイリングとは何ですか?

STRプロファイリングとは、"short tandem repeats"プロファイリングの略です。この検査では、種固有のSTRセグメントに基づいて種の同一性を確認します。例えば、ヒトのDNAに含まれる1〜6塩基対の繰り返しセグメントの存在を確認することで、その細胞株がヒト由来であることを確認するために使用されます。

自分の細胞のSTRプロファイリングは、どのような場合に行うべきですか?

  • 他から入手したばかりの細胞株を初めて使用する場合(特に新規の細胞株の場合)。
  • 組織サンプルから新しい細胞株を樹立し、それをジャーナルに発表したり、助成金の申請に使用したりする場合。
  • 培養中にコンタミネーションが発生していないか、数ヶ月ごとに定期的にチェックする。
  • 細胞の見た目や機能が期待通りでない場合。

培養した細胞の交差汚染を防ぐ方法はありますか?

細胞培養では、一度に複数の細胞株を扱う場合、異なる種の細胞がクロスコンタミネーションされることがよくあります。また、サンプルのラベル付けを間違えるなどのエラーもあります。クロスコンタミネーションの可能性を減らすために、以下のようなテクニックが必要です。

  • バイオセーフティーキャビネット内では、一度に1つの細胞株を扱い、アッセイの合間にはキャビネットおよび関連機器・材料はクリーンにする。
  • 細胞の形態、成長、機能の変化の可能性を定期的にモニターする(つまり、自分の細胞の特性をよく知っておく必要があります)。
  • 細胞培養物だけでなく、ラボで共有している機器、試薬、培地を汚染しないよう、無菌的な技術が必須です。
  • バイアル、フラスコ、プレートをラベルしておくと、サンプルを間違えるリスクが減ります。

 

ウイルス、病原体のコンタミネーション

他に気をつけるべき汚染はありますか?

細胞培養には、ウイルスなどの病原体が混入する可能性もあります。宿主由来のものには内在性のウイルスが含まれており、それが細胞培養に持ち込まれることがある他、動物由来の試薬にもウイルスが含まれていることがあります。一般的なウイルス汚染物質には、HPV、HBV、HSV、サイトメガロウイルス、パルボウイルスなどがあります。これらの汚染物質は、現在の細胞培養に悪影響を及ぼすだけでなく、これらの汚染物質が動物の宿主と接触した場合には、疾病の発生を引き起こす可能性があります。したがって、実験室のスタッフにとっての環境リスクをよりよく理解するために、細胞培養物に含まれる可能性のあるウイルス汚染物質のプロファイルを入手することは重要です。

参考文献

  1. Ligasová, A., Vydržalová, M., Buriánová, R., Brucková, L., Vecerová, R., Janostáková, A., & Koberna, K. (2019). A New Sensitive Method for the Detection of Mycoplasmas Using Fluorescence Microscopy. Cells, 8(12), 1510. https://doi.org/10.3390/cells8121510
  2. Reid Y, Storts D, Riss T, et al. Authentication of Human Cell Lines by STR DNA Profiling Analysis. 2013 May 1. In: Sittampalam GS, Grossman A, Brimacombe K, et al., editors. Assay Guidance Manual [Internet]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004-. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144066/
  3. Young, L., Sung, J., Stacey, G., & Masters, J. R. (2010). Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols, 5(5), 929?934. https://doi.org/10.1038/nprot.2010.43
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