マイコプラズマ (細菌の一種) は、細胞培養において極めて一般的なコンタミネーションの原因でありながら、肉眼はもちろん、光学顕微鏡でも検出することができません。マイコプラズマは0.2〜0.3µmと非常に小さいため、濁りやpHの変化を起こすことなく、細胞培養液中に高濃度で存在することができます。マイコプラズマのサイズはフィルターの孔を通過できるほど小さいので、培地をろ過してもマイコプラズマの汚染を防ぐことはできません。
なぜマイコプラズマは問題なのですか?
マイコプラズマは、細胞の行動のほぼすべての要因に影響を与え、以下を引き起こす可能性があります。
- 栄養素の枯渇や有害な代謝産物の分泌による増殖の阻害
- 免疫学的反応
- ウイルスの増殖やウイルス感染率への影響
- 染色体異常の発生
- マイクロアレイや遺伝子発現プロファイルの変化
- 細胞トランスフェクション率の低下
- DNAやタンパク質の分離ワークフローへの干渉
図2.3T3細胞の培養液にマイコプラズマが存在しない場合(A)と存在する場合(B)
マイコプラズマがコンタミネーションしているかどうかは、どうすればわかりますか?
マイコプラズマは、湿った状態でも乾燥した状態でも生存することができるため、ある培養物から別の培養物へ容易に移ることができます。マイコプラズマのコンタミネーションを検出するには、以下のような方法があります。
- 組織学的染色
- 酵素活性測定
- ELISAまたは蛍光検出
- DNA染色 (DAPIまたはHoechst 33258)
- PCRによるマイコプラズマDNAの増幅
上記の方法のほとんどは、時間がかかり、特殊な装置を必要とします。我々は、最も迅速で簡単なマイコプラズマの検出方法としてPCR法を推奨します。この方法では、細胞培養サンプル中のマイコプラズマDNAを増幅させ、ポジティブコントロールと比較します。
図3.マイコプラズマのPCRによるチェック
APB社のPCR Mycoplasma Detection Kit (品番:G238) を用いて検査した細胞培養物からの増幅産物を1%電気泳動アガロースゲルで測定した。
レーン1はネガティブコントロール、レーン2〜23は細胞培養サンプル、レーン24はポジティブコントロール。
Applied Biological Materials社 (APB社)のMycoplasma PCR Detection Kit (品番:G238) は、細胞培養上清から直接マイコプラズマDNAを増幅し、200種以上のマイコプラズマをわずか2時間で検出することができます。
マイコプラズマに汚染された細胞を救済することはできますか?
マイコプラズマとの戦いでは、ペニシリンやストレプトマイシンは効果がありません。マイコプラズマ汚染が確認された細胞株は、残りの培養細胞への汚染拡大を防ぐため、できるだけ早く細胞を廃棄してください。また、以下の方法の1つまたはすべてを用いて、培地や機器を洗浄するとよいでしょう。
細胞株が重要で廃棄できない場合は、テトラサイクリン、マクロライド、キノロンなどのマイコプラズマに有効な抗生物質を含む化学処理を行うことが、最も簡単な汚染除去の方法です。場合によっては、マイコプラズマの株が抗生物質のカクテルに耐性を持つことがあり、その場合には、効果のある抗生物質の混合物を見つけるために試行錯誤する必要があります。
細胞の種類によっては、抗生物質が害を及ぼす可能性があるため、抗生物質のカクテルを希釈する必要があります。マイコプラズマの除去によく使われる希釈液は、汚染の強さに応じて1:500、1:1000、1:10,000です。マイコプラズマの除去には、数週間から数ヶ月かかることが多いことを覚えておいてください。
Applied Biological Materials社 (APB社)のMycoplasma Elimination Cocktail (品番:G398) は、ほとんどの哺乳類細胞株に対して非毒性であり、培養中の培地に直接添加することで、わずか4継代(2週間)でマイコプラズマを除去することができます。