Cell Research社　ヒト皮膚・瘢痕研究用細胞培養方法

 商品情報 初代表皮培養細胞

細胞がお手元に届いたら
1. 容器からの漏れや破損の有無をチェックしてください。
2. 凍結状態でお届けの場合 -
　輸送箱内にドライアイスが十分残っているか確認し、凍結バイアルを液体窒素保管容器へ移します。
3. 培養状態でお届けの場合 -
　細胞の入ったフラスコを70%エタノールあるいはイソプロパノールで拭き、
　37℃、5%CO₂の加湿インキュベーターにて3-4時間静置します。
　細胞が平衡状態になったらフラスコ中の培地を交換してください。

1-1 細胞培養用推奨培地および試薬

・EpiLife Basal Medium（Cascade Biologics, 品番M-EPI-500-CA）： 500mL/bottle

・EpiLife Defined Growth Supplement（EDGS）： 5mL/vial
『EpiLife Growth Medium』をEpiLife Basal MediumにEDGS 1%、抗生剤/抗真菌剤 1%になるように加えて調製します。

・ 1x Trypsin-EDTA 溶液（Trypsin-EDTA（10X）, 0.5% Trypsin with EDTA（品番15400-054, Invitrogen Corp. 使用前に希釈して用いてください）

1-2 凍結バイアルからの細胞播種

通常、細胞製品は培養状態でお届けいたしますが、ご希望により凍結バイアルでのお届けも可能です。凍結細胞の播種については下記をご参考ください。

1. ヒト表皮ケラチノサイトの播種は、3.3×10³ cells/(あるいは2.5×10⁵ cells/T75フラスコを推奨します。播種してから5-7日後には70-80%コンフルエントの状態になります。

2. 凍結バイアルを融解させる前に速やかにバイアルをエタノールあるいはイソプロパノールで拭き、クリーンベンチ内でキャップをゆっくりと4分の1ほどまわして圧を逃がし、再びきつく締めます。

3. 凍結バイアルを37℃のウォーターバスですばやく融解させます。バイアル全体を水中に沈めないよう注意してください。

4. マイクロピペットを用いて細胞を再懸濁し、予めEpiLife Growth Mediumを加えた培養容器に分注します。穏やかに培養容器を揺り動かして細胞を均一に広げ、インキュベーターに戻します。

5. 細胞から凍結保護液を除くために遠心分離を行うと、DMSOが培養に影響を与える以上に細胞にダメージを与えますので、遠心分離は行わないでください。

1-3 ヒト表皮ケラチノサイトの継代

以下の操作では75cm²フラスコを用いています。ご使用のフラスコサイズによって容量を調整してください。

1. 細胞が70-80%コンフルエントの状態になったら継代します。
ご注意： 細胞が80%コンフルエント以上にならないようにしてください。細胞が増殖停止し継代時に増殖しなくなる場合があります。

2. 75cm²フラスコ１個あたり、以下の操作で行います。
  ・フラスコに温めた1xTrypsin/EDTAを5mL加える
  ・37℃インキュベーター内でインキュベーションする（5分以内）
  ・穏やかに揺らして細胞をフラスコ底面から剥がす
  ・遠心分離用チューブに移す
  ・しっかりとピペッティングを行い細胞塊をなくす
  ・DMEM/10% FCSを45加えてトリプシン作用を中和する
  ・1200 rpmで5分間遠心分離する
  ・細胞ペレットをEpiLife Growth Mediumに懸濁し、実験を続けるあるいは凍結保存する

3. 一度に1-3フラスコ分を継代できます。

4. 細胞はEpiLife Growth Medium/10% DMSO溶液で凍結保存します。細胞密度は1バイアルあたり5.0×10⁵−2.0×10⁶ cells/2mLを推奨します。

2-1 細胞培養用推奨培地および試薬

・10% FBSおよび1% 抗生剤/抗真菌剤を加えたDMEM
・1x Trypsin-EDTA 溶液（Trypsin-EDTA（10X）, 0.5% Trypsin with EDTA Cat#15400-054, Invitrogen Corp.）

2-2 凍結バイアルからの細胞播種

 通常、細胞製品は培養状態でお届けいたしますが、ご希望により凍結バイアルでのお届けも可能です。凍結細胞の播種については下記をご参考ください。

1. ヒト皮膚線維芽細胞の播種は、3.3×10³ cells/,あるいは2.5×10⁵ cells/T75フラスコを推奨します。播種してから5-7日後には100%コンフルエントの状態になります。

2. 凍結バイアルを融解させる前に速やかにバイアルをエタノールあるいはイソプロパノールで拭き、クリーンベンチ内でキャップをゆっくりと4分の1ほどまわして圧を逃がし、再びきつく締めます。

3. 凍結バイアルを37℃のウォーターバスですばやく融解させます。バイアル全体を水中に沈めないよう注意してください。

4. マイクロピペットを用いて細胞を再懸濁し、予め用意しておいた培養容器に分注します。穏やかに培養容器を揺り動かして細胞を均一に広げ、インキュベーターに戻します。

5. 細胞から凍結保護液を除くために遠心分離を行うと、DMSOが培養に影響を与える以上に細胞にダメージを与えますので、遠心分離は行わないでください。

2-3 ヒト皮膚線維芽細胞の継代

以下の操作では75cm²フラスコを用いています。ご使用のフラスコサイズによって容量を調整してください。

1. 細胞が80-90%コンフルエントの状態になったら継代します。

2. 細胞75cm²フラスコ1個あたり、以下の操作で行います。
・フラスコに温めた1x Trypsin/EDTAを55加える
・インキュベーター内でインキュベーションする（5分以内）
・穏やかに揺らして細胞をフラスコ底面から剥がす
・遠心分離用チューブに移す
・しっかりとピペッティングを行い細胞塊をなくす
・DMEM/10% FCSを45加えてトリプシン作用を中和する
・1200 rpmで5分間遠心分離する
・細胞ペレットをDMEM/10% FCSに懸濁し、実験を続けるあるいは凍結保存する

3. 一度に1-3フラスコ分を継代できます。

4. 細胞はDMEM/10% DMSO溶液で凍結保存します。細胞密度は1バイアルあたり5.0×10⁵−2.0×10⁶ cells/2mLを推奨します。