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記事ID : 17897

Ludger社シアル酸(Neu5Ac、Neu5Gc)の定量


背景

シアル酸分析は、バイオ医薬品の特性評価に関するICH Q6Bガイドラインに規定されている規制要件です。特に一部の患者は高レベルの抗Neu5Gc抗体を有し、これがNeuGc含有バイオ医薬品の中和や除去をもたらし得るため(Nguyen et al. 2005)、ヒト型(Neu5Ac)および非ヒト型(Neu5Gc)シアル酸の相対レベルの決定は非常に重要です。糖タンパク質を分析する際のNeu5Ac及びNeu5Gcは、しばしばバイオ医薬品の重要品質特性(Critical Quality Attribute, CQA)と見なされています。

一般的なNeu5Ac、Neu5Gc比率を決定する方法

  1. 弱酸加水分解による、糖タンパク質の末端シアル酸残基の放出。
  2. 放出されたシアル酸のDMB(1,2-diamino-4,5-methylenoxybenzene)による蛍光ラベリング。
  3. HPLC、UHPLCによる相対定量分析。

LudgerTag™DMBキット(品番:LT-KDMB-A1)は、糖タンパク質からシアル酸を放出し、それらをDMB標識する為に必要なものが全て含まれています。このキットには、最大22サンプル分(50〜100 µgの糖タンパク/1サンプル)の試薬が含まれています。1サンプルあたり約10 pmol〜2.5 nmolのシアル酸が検出可能です。

キットには、シアル酸リファレンスパネル(品番:CM-SRP-01)及びNeu5Ac、Neu5Gcの定量スタンダードが含まれています。これらのスタンダードは、放出されたシアル酸サンプルと同時にDMBでラベルすることができます(図1)。定量スタンダードの段階希釈物を用いてスタンダードカーブを描くことで定量分析も可能となります。(リファレンスパネル、各定量スタンダードは単品でも販売しております。)

ポジティブコントロールには、Neu5AcとNeu5Gcを含むフェチュイン(品番:GCP-FET-50U-X4)やグリコペプチドスタンダード(品番:BQ-GPEP-A2G2S2-10U)をお勧めしています(非同梱)。グリコペプチドスタンダードは、A2G2S2グリカンを持つペプチドで、グリカンの放出、ラベリング、回収の効率を確認することができ、シアル酸測定の精度を確認できます。また、ヒトエリスロポエチン(EPO)に存在するNeu5,9Ac2の同定に使用できるスタンダード(品番:CM-NEU5,9AC2-01)もございます(非同梱)。いずれも使用バッファーをネガティブコントロールとして使用することができます。

    参考文献

  1. Nguyen DH, Tangvoranuntakul P, and Varki A. (2005) Effects of Natural Human Antibodies against a Nonhuman Sialic Acid That Metabolically Incorporates into Activated and Malignant Immune Cells. J Immunol 175:228-236.

DMB標識したシアル酸リファレンスパネルを、uR2 UHPLCカラム(品番:LS-UR2-2.1x100)を用いて分析
図1. DMB標識したシアル酸リファレンスパネルを、uR2 UHPLCカラム(品番:LS-UR2-2.1x100)を用いて分析した。

本キット 品名 メーカー 品番
LudgerTag™ DMB Sialic Acid Labelling Kit LUD LT-KDMB-A1
関連製品 スタンダード、ポジティブコントロール
Fetuin Glycoprotein (4 x 50 ug) LUD GCP-FET-50U-X4
BioQuant A2G2S2 glycopeptide standard LUD BQ-GPEP-A2G2S2-10U
N-acetylneuraminic acid qualitative standard LUD CM-NEU5,9AC2-01
N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac or NANA) quantitative standard LUD CM-NEU-AC-01
N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc or NGNA) quantitative standard LUD CM-NEU-GC-01
Sialic acid reference panel LUD CM-SRP-01
HPLC, UHPLCカラム
LudgerSep™ R1 HPLC Column LUD LS-R1-4.6x150
LudgerSep™ uR2 UHPLC Column LUD LS-UR2-2.1x100
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
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