免染の基礎、ポジコン・ネガコンの役割を解説免疫染色(IHC)における陽性 / 陰性コントロールの役割

免疫染色(IHC)のサンプル調製やサンプル染色過程の最適には、時間や労力を要する作業です。条件最適化が上手くいくと、強い特異的シグナルが得られます。しかしながら、結果が正しく解釈されているか、どのようにして判断すべきでしょうか。免疫染色(IHC)実験では、陽性(ポジティブ)コントロールと陰性(ネガティブ)コントロールを同時に使用することが非常に重要です。人為的なミスがなかったかどうか、あるいは、得られた染色結果が正確かつ妥当であるかどうかを検証することができる、とても有益な情報源です。

現在、免疫染色の特異性決定に役立つ免疫染色(IHC)コントロールが6種確立されています。

Cosmo Bio would like to acknowledge and thank the Boster Immunoleader for providing IHC control information presented here.

陽性組織コントロールとして、対象のタンパク質を発現することがわかっている組織種を染色します。結果が期待通りの陽性であれば、アッセイは適切に機能しています。もし陽性コントロールが染色できない場合には、染色プロトコールのトラブルシューティングを行います。

多くの抗体のデータシートには、Uniprot ID が記載されていますので、これを元に対象のタンパク質が発現している組織リストを入手し、陽性コントロールとして使用することができます。

陰性組織コントロールは、非特異的結合や偽陽性結果を明らかにするために、対象タンパク質を発現しないことがわかっている組織を選択します。つまり、標的抗原を発現しない組織であることが重要です。陰性組織コントロールが染色された場合には、染色が非特異的であるといえます。陰性コントロール組織として、ノックダウン（KD）やノックアウト（KO）組織を使用することが一般的です。

特定の細胞や組織種、特にコラーゲン、エラスチン、およびリポフスチンが豊富なものは、天然の蛍光（自己蛍光としても知られる）を放つ固有の生物学的特性を持っています。もしこれに気がつけないと、実際はバックグラウンド染色であるのにも関わらず、陽性染色と誤解する可能性があります。これを防ぐためには、組織の一部を蛍光顕微鏡で調べるか、明視野顕微鏡で発色性を調べ、実験に使用する組織が内在性バックグラウンドを呈しないことを確認します。

非一次コントロール（二次抗体用コントロールとしても知られる）は、その名の通り、プロトコールから組織と一次抗体との培養ステップを除いたものです。サンプルは、一次抗体を添加していない抗体希釈液のみで培養します。その後、サンプルを二次抗体や他の検出試薬とともに培養します。これは、二次抗体が細胞成分に非特異的に結合し、偽陽性や非特異的結合を生じていないか確認するために行います。

実験にモノクローナル抗体を使用する場合には、アイソタイプ コントロールを含めた実験を考慮します。アイソタイプ コントロールとは、一次抗体とアイソタイプ（例えば、IgG2, IgM, IgYなど、サブクラスともいう。）、標識物、および宿主生物種が同一の抗体であり、特定のタンパク質を標的しない抗体です。アイソタイプ コントロールは、化学物質や非哺乳動物タンパク質を利用する場合もあります。

アイソタイプ　コントロールは同一実験条件下で、一次抗体の代わりに一次抗体と同じ濃度で培養します。この結果は、得られた染色結果が本当に特異的でありサンプルと抗体の非特異的相互作用によるものではないことを検証するために有用です。

吸収コントロールは、一次抗体が対象の抗原に特異的に結合するかどうかを確認するために使用します。抗体をまず免疫原と一晩共培養します。飽和後、免疫染色のプロトコールで一次抗体を使用するところを不活化した抗体に置き換えてコントロールとします。このとき、特異的抗体結合部分において組織の染色は本来のサンプル染色に比べてほとんど、または、まったく生じないはずです。

吸収コントロールは、抗原として精製ペプチドを使用した場合には有益ですが、抗原がリコンビナントタンパク質の場合、タンパク質と組織間で非特異的結合が生じ、誤った解釈を誘導する可能性があるため注意が必要です。