Alomone Labs（ALO）社　ライブセルイメージング法(細胞外領域認識抗体を用いた生細胞の免疫染色)

【目次】

• 細胞の準備
• 間接法
• 直接法
• 適用例

1. チャンバースライドに細胞を播種し、適切な培地で1〜2日間培養を行う (細胞はプレートに強く接着する必要があります)。
   注意：一部の細胞株では、細胞の付着を助けるために、チャンバースライドにポリリジンなどの特別なコーティングが必要となります。コーティングの具体的な種類は、チャンバーの種類や細胞株によって異なるため、経験的に決定する必要があります。
2. 氷冷したアッセイバッファーで細胞を3回洗浄する。

以下の間接法、あるいは直接法にて染色を行います。

1. 氷冷したアッセイバッファーに、適切な希釈率の一次抗体を加える。
2. 4℃で1〜2時間インキュベートする。
3. 氷冷したアッセイバッファーで細胞を3回洗浄する。
4. 氷冷したアッセイバッファーに適切な希釈率の蛍光標識二次抗体を加え、遮光して4℃で1時間インキュベートする。
5. DAPI（脱イオン水またはジメチルホルムアミド（DMF）に溶解した5mg/mlストック溶液を作製し、最終的にはICC-PBSで500nMに希釈）を加え、室温で5分間インキュベートします。
6. 氷冷したアッセイバッファーで3回洗浄し、よく水を切ります。
7. ICC-PBSを加えて細胞を覆い、顕微鏡観察を行う。

1. 氷冷したアッセイバッファーに、ATTO標識一次抗体を適切な希釈率で加える。
2. 4℃で1時間インキュベートする。
3. DAPI（脱イオン水またはジメチルホルムアミド（DMF）に溶解した5mg/mlストック溶液を作製し、最終的にはICC-PBSで500nMに希釈）を加え、室温で5分間インキュベートします。
4. 氷冷したアッセイバッファーで3回洗浄し、よく水を切ります。
5. ICC-PBSを加えて細胞を覆い、顕微鏡観察を行う。

図１．GH3細胞におけるα_1B-アドレノセプターの発現
生きたGH3細胞におけるα_1B-adrenoceptor細胞表面領域の検出。
細胞を Anti-α_1B-Adrenergic Receptor (extracellular) Antibody (AAR-018) (1:100)で染色した後、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488二次抗体(緑)で染色した。細胞核は、DNA色素Hoechst 33342（青）で染色した。

図２．PC12細胞におけるノルアドレナリントランスポーター(NET)の発現
生きたPC12細胞におけるNET細胞表面領域の検出。
細胞を Anti-Noradrenaline Transporter (extracellular) Antibody (AMT-002) (1:100)で染色した後、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 594二次抗体(赤)で染色した。細胞核は、DNA色素Hoechst 33342（青）で染色した。

図３．ヒトCOLO-205細胞におけるKCNQ1の発現
生きたCOLO-205細胞におけるKCNQ1細胞表面領域の検出。
(A) Anti-KCNQ1 (extracellular) Antibody (APC-168) (1:50)、続いてヤギ抗ラビットAlexaFluor-488二次抗体(緑)を用いた細胞外染色像。(B)細胞のライブビュー。(C) AとBのマージ像。

図４．ヒトU-87細胞におけるKir4.1の発現
生きたU-87細胞におけるKir4.1細胞表面領域の検出。
(A) Anti-Kir4.1 (KCNJ10) (extracellular) Antibody (APC-165) (1:100)、続いてヤギ抗ラビットAlexaFluor-594二次抗体(赤)を用いた細胞外染色像。(B)細胞のライブビュー。(C) AとBのマージ像。