SERVA（SER）社　二次元電気泳動用蛍光プレラベル試薬　SERVA HPE™ Lightning Red

標識の手順は簡単・迅速で、精製や遠心分離などの操作は必要ありません。また、電気泳動終了後、検出のために特別な処理を行う必要もありません。

各色素分子は一つの正電荷を持ち、標識タンパク質の等電点は非標識タンパク質と変わりません。二次元目の SDS-PAGE において移動度はほとんどシフトせず、標識タンパク質と非標識タンパク質の移動度に差は見られません。その理由は、質量付加が分子当たりわずか 288 Da と小さく、色素の疎水性が低いからです。したがって、標識タンパク質と非標識タンパク質を混合して二次元電気泳動を行っても、分離パターンに差は検出されません。

従来、高感度な検出が必要な際には、二次元電気泳動ゲルに銀染色を行っていました。しかし、銀染色のスポットは非常に早く飽和することから、スポットの定量化は不可能です。同じゲルを直接比較すると（図2参照）、銀染色では非常に強度の高いスポットが多数検出されますが、蛍光標識では定量化が可能なスポットがより多く検出されます。

図2　プレラベルした E. coli ライセート 20μg を、SERVA IPG BlueStrip (7cm, pH 5-8　品番： 43006) で分離し、続いて SERVAGel™ TG PRiME™ 14 % 垂直型ミニゲル（品番： 43271）で SDS-PAGE により分離した。
A: Typhoon イメージアナライザーを用いた蛍光スキャン画像
B: SERVA HPE™ 銀染色キット（品番： 43395）を使用して後から染色（染色過剰、多くのスポットが飽和している）

蛍光色素は、一級アミノ基（例： タンパク質やペプチドのリジン残基のε-アミノ基）に結合します。標準的には、タンパク質 1μg を 80 pmol SERVA HPE™ Lightning Red で標識します。 検出感度の向上のために、タンパク質に対する色素の量を増やしても、ネガティブな影響はありません。標識タンパク質の検出には蛍光イメージャー（カメラ／スキャナー）を使用します（励起波長： 約 530 nm、蛍光波長： 610 nm［バンド幅： 30 nm］）。 結合した色素は、最大 0.60 の量子収率（QY *）を示し、スポットあたりタンパク質 100 pg まで検出が可能です。

質量分析用に、スポットをゲルからピッキングしたい場合は、ゲルを酢酸（またはクエン酸）とアルコールで固定することが可能で、少なくとも 10日間はシグナル強度が保たれます。必要であれば、様々な方法で（CBB、銀染色など）、ゲルを後から染色することができます。

* 蛍光量子収率は、蛍光分子に吸収された光子数と、蛍光によって放出された光子数の比として定義されます。

1. SERVA HPE™ Lightning Red 250μg を、水を含まないジメチルホルムアミド（DMF） 25μL に溶解します。調製した蛍光色素溶液は、-20℃で少なくとも6ヶ月間安定です。
2. タンパク質を変性溶解バッファーで懸濁します。
3. 通常は、タンパク質 1μg を、80pmol SERVA HPE™ Lightning Red で標識します。
   （例： タンパク質溶液 30μL （10μg タンパク質／μL 溶解バッファー）に、蛍光色素溶液 1μL を加えます。）
4. 優しく混合し、バイアルを 0℃で 15分間インキュベートします。
5. 膨潤バッファーにサンプルを混ぜる、もしくは、サンプルカップを使用して、標識タンパク質溶液を IPG ストリップ にアプライします。