7.　トラブルシューティング　SAFETRANS (Lac-α-CDE)

(1) Lac-a-CDE Transfection reagent と pDNA (siRNA) のチャージ比が不適
Lac-a-CDE Transfection reagent と pDNA (siRNA) のチャージ比が最適でない場合には、Lac-a-CDE Transfection reagent – pDNA (siRNA) 複合体の正味電荷が負、中性あるいは極端に正となり、細胞表面への吸着が非効率的となる。よって、Lac-a-CDE Transfection reagent と pDNA (siRNA) のチャージ比を変更する。

(2) Lac-a-CDE Transfection reagent – pDNA (siRNA) 複合体量が不充分
トランスフェクション効率が低いが、細胞障害性は観察されない場合は、Lac-a-CDE Transfection reagent - pDNA 複合体を増量する。

(3) pDNA (siRNA) と Lac-a-CDE Transfection reagent の混合の際に、血清入りの培地を使用している
無血清の培地を使用する。

(4) pDNA (siRNA) と Lac-a-CDE Transfection reagent 複合体形成後、時間を空けて使用した
複合体調製処理後、速やかにトランスフェクションする。

(5) 遺伝子発現、RNAi 効果発現のためのインキュベーション時間が不適
トランスフェクション後の最適インキュベーション時間は細胞系により異なる。最適インキュベーション時間が不明の場合には、遺伝子発現および RNAi 効果発現レベルと経過時間の相関関係を調べる実験を行う。

(6) ベクターの影響
プロモーター、複製起源および pDNA のサイズなどのファクターは遺伝子発現率に影響を及ぼす。トランスフェクションに使用した pDNA の量もプラスミドの発現率に影響する。

(7) Lac-a-CDE Transfection reagent – DNA (siRNA) 複合体の添加時における細胞密度が高すぎる
付着細胞の場合には、複合体添加時の最適な細胞密度は通常 40~60%。

(8) pDNA (siRNA) の純度が低い
トランスフェクションには、純度の高い pDNA (siRNA) を使用する。 pDNA (siRNA) 精製中に存在する不純物によりトランスフェクション効率は著しく低下する。

(9) レポーターアッセイが問題
レポーターアッセイの測定法が確実に最適となるよう、ポジティブコントロール実験を常に一緒に行う。

(1) Lac-a-CDE Transfection reagent – pDNA (siRNA) 複合体と細胞との接触時間が長すぎる。
ほとんどの付着細胞では、Lac-a-CDE Transfection reagent – pDNA (siRNA) 複合体と 2~3 時間インキュベートすることにより、最適な結果が得られる。しかし、感受性の高い細胞や、Lac-a-CDE Transfection reagent での処理後に極端に高い死亡率を示した細胞系の場合には、Lac-a-CDE Transfection reagent – pDNA (siRNA) 複合体とのインキュベーション時間を短縮する。

(2) Lac-a-CDE Transfection reagent – pDNA (siRNA) 複合体量が多すぎる。
細胞と複合体との接触時間の短縮にも関わらず、多くの細胞死が観察された場合には、Lac-a-CDE Transfection reagent と pDNA (siRNA) の比率を変えることなく Lac-a-CDE Transfection reagent – pDNA (siRNA) 複合体の量を減らす。

(3) 細胞へのストレス
洗浄操作は、素早く行う。温度差による細胞へのストレスを避ける。

(4) 無血清培地での長時間の培養
トランスフェクション時には、無血清培地を使用するが、その後、2~3 時間後には最終濃度が 10% になるように血清を添加して、インキュベーションを行う。

(1) 実験毎に細胞集密度が異なる
播種する細胞数を正確にする。細胞を播種後、複合体を添加するまでの間のインキュベーション時間を実験毎に一定に保つ。

(2) マイコプラズマのコンタミ
マイコプラズマのコンタミはトランスフェクション効率に影響を及ぼす。マイコプラズマに感染した細胞の増殖の変化により、実験毎のトランスフェクション効率が変動する。

(3) 細胞の継代回数が多すぎる
細胞の継代回数が非常に多い場合、細胞の形態、特性およびトランスフェクション効率が変化する可能性がある。なるべく継代回数の少ない細胞の使用を推奨。

(4) 血清の品質が異なる
血清の品質の差異によりトランスフェクション効率が変動し得る。一般に、トランスフェクション実験を行う前に、血清のロットチェックをしておく。

(1) pDNA (siRNA) の精製度が低い。

(2) pDNA (siRNA) と Lac-a-CDE Transfection reagent との混合比率が適当でない。

(3) pDNA (siRNA) を溶解している溶液の組成が適当でない。

(4) Lac-a-CDE Transfection reagent が古くなり、沈殿物が認められるようになった