記事ID ： 1500

GTP の加水分解によって生じた Pi を測定 RhoGAP アッセイキット

メーカー名：Cytoskeleton, Inc

RhoGAP（GTPase 活性化タンパク質）アッセイキットは、GTP の加水分解（GDP + Pi）によって生成した無機リン酸（Pi）の量を測定するキットです。
96ウェル／384ウェルフォーマットでご使用いただけます。

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背景

GTPase 活性化タンパク質（GAP： GTPase Activating Protein）

低分子量 GTPaseの Ras スーパーファミリー（例： Ras、Rho、Rab、Arf、Ran タンパク質）は、GDP結合型の「不活性化状態」と、GTP結合型の「活性化状態」とを循環するスイッチとして機能します。細胞内では、主に2種類の調節タンパク質によって、この2つの状態の循環が制御されています。活性化に関与するグアニンヌクレオチド交換因子（GEF： Guanine nucleotide Exchange Factor）と、不活性化に関与する GTPase 活性化タンパク質（GAP： GTPase Activating Protein）です。

Ras スーパーファミリーの低分子量Gタンパク質には、一般的に固有の GTPase 活性があることが知られており、GEF によって活性化（GTP結合型）されると、最終的には固有の GTPase 活性により不活性型に戻ります。しかし、固有の GTPase 活性は速度が非常に遅く、時間がかかります。

ほとんどの Ras スーパーファミリー GTPase では固有の GTPase 活性の速度が遅いことから、GAP がシグナル伝達を終了させるための重要なシグナル伝達分子として機能します。GAP は、活性化型（GTP結合型）のターゲットGタンパク質に結合して GTPase 活性を促進し、Gタンパク質を急速に不活性化します。

GTPase molecular switch

使用目的

未同定の GAP に特異的な GTPase 活性の測定
低分子量 GTPase および GAP の生化学的検討
様々なコファクターやタンパク質ドメインによる GAP 活性の調節の検討
GAP 変異タンパク質／GTPase 変異タンパク質の活性や基質特異性のスクリーニング
ハイスループットスクリーニング（HTS）による GAP 阻害剤の同定

構成内容

本キットには、96ウェルプレートで 20アッセイ／各 GTPase、384ウェルプレートで 40アッセイ／各 GTPase 分の試薬が含まれています。

反応バッファー
His-tagged Cdc42 タンパク質
His-tagged Rac1タンパク質
His-tagged RhoA タンパク質
His-tagged Ras タンパク質
GST-tagged p50RhoGAP（触媒ドメイン）
GTP ストック
CytoPhos™ 試薬
96 ウェルクリアハーフエリア平底プレート

その他　必要な機器

分光光度計（650 nm）

使用例

図1 RhoA タンパク質による GTP 加水分解を測定し、RhoGAP 活性を検討した。

図1 RhoA タンパク質による GTP 加水分解を測定し、RhoGAP 活性を検討した。
反応バッファー＋GTPに、それぞれ下記を加えて反応させた。

RhoA： RhoA のみ
GAP： RhoGAP のみ
RhoA + GAP： RhoA + RhoGAP

37℃で20分間インキュベートした後、CytoPhos™ 試薬を添加し、GTP の加水分解で生じたリン酸の量を 650 nm の吸光度で測定した。

Rho GAP アッセイキット

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Rho GAP Assay Kit (non-radioactive)	CYT	BK105	1 KIT [80-160 assays]	￥208,000

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品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
RhoGEF Exchange Assay	CYT	BK100	1 KIT [60-300 assays]	￥209,000

製品使用文献

Taniuchi et al., 2012. BART Inhibits Pancreatic Cancer Cell Invasion by Rac1 Inactivation through Direct Binding to Active Rac1. Neoplasia. v 14, pp 440–450.
Gaus et al., 2011. Destabilization of YopE by the Ubiquitin-Proteasome Pathway Fine-Tunes Yop Delivery into Host Cells and Facilitates Systemic Spread of Yersinia enterocolitica in Host Lymphoid Tissue. Infect. Immun. v 79, pp 1166-1175.
Zhang et al., 2010. A Novel Testis-specific GTPase Serves as a Link to Proteasome Biogenesis: Functional Characterization of RhoS/RSA-14-44 in Spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. v 21, pp 4312–4324.
Rothenfluh et al., 2006. Distinct Behavioral Responses to Ethanol Are Regulated by Alternate RhoGAP18B Isoforms. Cell. v 127, pp 199–211.