ヌクレオチド転移酵素をダイレクトに検出するハイスループットアッセイ BellBrook社Transcreener® ヌクレオチド転移酵素アッセイキットのご紹介
ヌクレオチド転移酵素をダイレクトに検出するハイスループットアッセイ

ヌクレオチドは、細胞内の様々な反応に関与する細胞内情報伝達物質です。アデニン／グアニンヌクレオチドを必要とするプリノーム酵素は、ヒトゲノムの13%を占めます。アセチルCo-Aカルボキシラーゼのようにまだあまり明らかになっていないATP依存性酵素と同様に、脂質キナーゼや、ATPaseおよびGTPase活性を持つシャペロニンが、近年創薬研究で注目されています。

BellBrook社のTranscreener® アッセイキットは、ヌクレオチド依存性酵素全般にわたって使用できるユニバーサルアッセイです。ADP, AMP, GMP, GDP, UDPの各種ヌクレオチドを生成する酵素全般をアッセイし、またこのシステムを利用したTranscreener® EPIGENアッセイキットでは、Methyltransferase全般を包括的にアッセイします。

Fig.1　4種類のTranscreener® アッセイキットで、様々なヌクレオチド依存性酵素がアッセイできます。

● キナーゼ、ATPase、GTPaseを含む数千におよぶ酵素を検出。
● ダイレクト検出法により化合物干渉を低減。
● マルチリーダーで測定可能
● 混ぜて測定するだけのワンステップアッセイ：8時間設置、安定シグナルで簡単自動化

アッセイ種別	検出方法	ターゲット酵素
	・FP ・FI ・TR-FRET	Protein Kinases, Lipid kinases, Carbohydrate kinases, ATPases, chaperonins (Hsp90, etc), nucleotideases, carboxylases, helicases
	・FP ・TR-FRET	Phosphodiesterases, Ub ligase, SUMO ligase, DNA ligase, Acyl CoA syntetase, AA‐tRNA synthetase, NAD synthetase, Sialyltransferaes (CMP)
	・FP ・FI ・TR-FRET	Any GTPase: Gα proteins, Ras‐like G proteins (Ras, Roc, Rac, cdc42, etc), GTPase accelerating proteins (GAPs), Fucosyltransferases
	・FP	Glycosyltransferases (glucosyltransferase, glucuronosyltransferases, galactosyltransferase, etc), glycogen synthetase
	・FP	Histone MTs, DNA MTs, Protein arginine MTs, Catecholamine MTs, Histamine MT, Phenylethanolamine MT

FP（蛍光偏光法）、FI（蛍光強度法）、TR-FRET（時間分解蛍光共鳴エネルギー転移法）

酵素反応によって生成したヌクレオチドが、抗体に結合しているトレーサーと置換され、置換によって遊離したトレーサーの蛍光変化を測定します。トレーサーの蛍光検出方法は、FP（蛍光偏光法）、FI（蛍光強度法）、TR-FRET（時間分解蛍光共鳴エネルギー転移法）の3種類の方法があります。
一般的なヌクレオチド検出システムは、生成したヌクレオチドをカップリング酵素によってレポーター酵素が使用できる産物に変換します。そのため、これらの酵素がスクリーニング化合物のターゲットになる可能性があり、偽陽性やヒット欠落のリスクが高まります。

■　検出種別

Transcreener® は、リン酸基やメチル基のヌクレオチド間の違いを認識できる高精度な特異的抗体を使用しています。全てのTranscreener®アッセイは、初期基質濃度の全範囲にわたって10%未満の基質変換時(ADP/ATP比)において、0.7以上のZ’値を生み出します。
ダイレクト検出は、非常に簡便なプロトコルです。お客様の酵素反応を実行して、Transcreener® 試薬の停止混合液を添加し、プレートを読み込むだけです。Transcreener® 抗体とトレーサーは非常に安定した分子です。プレミックスしたこの検出混合液は、長期間の室温保存が可能です。また、Transcreener® の蛍光シグナルは少なくとも一晩か数日持続するので、プレートは検出試薬を添加した後も長い間読み取ることができます。これらの性質によってTranscreenerh® は、簡単に自動化HTS環境でご使用可能です。

Fig.2　低濃度ADP生成における高感度検出。20μM ATPを使用してPKAを検出した。

BellBrook社では各Transcreener®アッセイで最大のパフォーマンスを得るためにマルチモードリーダーの主要メーカーと提携しています。BellBrook社のバリデーション基準では、初期速度条件（≦10%基質変換時）でヌクレオチドを検出するため、Z’値0.7以上を必要とします。どのような蛍光検出モードや装置でも、Transcreener® アッセイ試薬を用いて確かな結果を得ることができます。