赤色蛍光カルシウム指示薬 カルシウム指示薬 Cal-590™ および Cal-630™

Cal-590™ および Cal-630™は、最も一般的に使用されている赤色蛍光カルシウム指示薬Rhod-2およびX-Phod-1の細胞導入とカルシウム応答を改善しつつ、それらと同様のスペクトル波長をもつ赤色蛍光カルシウム指示薬です。

Cal-590™ および Cal-630™のスペクトルはFITC、Alexa Fluor®488およびGFPと良好に分離できていることから、GFP細胞株やFITC/Alexa Fluor®488修飾抗体を用いた細胞内アッセイのマルチプレックスを行う上で理想的なカルシウムプローブです。

Rhod-2 や X-Rhod-1 は赤色蛍光カルシウム指示薬として一般的に使用されています。しかし、これらの蛍光指示薬は、生細胞中でエステラーゼにより加水分解を受けた際、中程度の蛍光しか発せず、細胞のカルシウム応答感受性が非常に弱いことが問題です。また、主にミトコンドリアに局在化してしまうため、細胞内に均一に局在せず、シグナル/バックグラウンド比が小さくなってしまいます。

Cal-590™ は Phod-2 AM の、Cal-630™は X-Rhod-1の細胞導入率とカルシウム応答感受性を改善しつつ、それぞれ類似したスペクトル波長を持つよう開発された色素です。Cal-590™ は Texas Red®フィルターセットで、Cal-630™はTexas Red® フィルターセットと互換性があります。CHO細胞およびHEK細胞において、Cal-590™ 、Cal-630™ の細胞内カルシウム応答感受性は、それぞれPhod-2 AM 、X-Rhod-1 に比べてより一層高いことが示されています。

Cal-590™

• 細胞導入とカルシウム応答がPhod-2 AMよりも良好
• TRITC/Cy3® フィルターセットと互換性あり

Cal-630™

• 細胞導入とカルシウム応答がX-Rhod-1よりも良好
• Texas Red® フィルターセットと互換性あり

図.1 Cal-500™、Cal-520®、Cal-590™、Cal-630™、Cal-670™、およびCal-700™のノーマライズした蛍光スペクトル

図.2 塩化カルシウム(5mM)存在下におけるCal-590™ 励起と蛍光スペクトル

図.3 0 - 39 µM 遊離Ca²⁺存在下におけるCal-590™ 蛍光スペクトル

図.4 Cal-590™ AMもしくはRhod-2® AM による、ATP刺激した CHO-K1細胞内在性P2Y受容体の細胞内カルシウム応答 (蛍光プレートリーダー解析)
ATP刺激した CHO-K1細胞内在性P2Y受容体の細胞内カルシウム応答を Cal-590™ AM (赤色、品番 20510) または Rhod-2® AM (青色、品番21064) で測定した。CHO-K1細胞を 96 well 黒壁/透明底コースタープレートの播種 (50,000 cells /100 µL) し、一晩培養した。2.5 mM プロベネシドと5 µg/mL Cal-590™ AMまたはRhod-2® AM を100 µLずつ細胞に添加し、37℃で1時間培養した。表記した最終濃度となるようATP (50 µL/well) をFlexStation® (Molecular Devices )を使って添加した。

図.5 プロベネシドを添加したCal-590™ AM による、ATP刺激した CHO-K1細胞内在性P2Y受容体の細胞内カルシウム応答 (蛍光顕微鏡観察)
CHO-K1細胞を96 well 黒壁/透明底コースタープレートに播種 (40,000 cells/100 µL)し、一晩培養した。1mM プロベネシドを添加した HHBS に 4 µM Cal-590™ AM (品番 20510) を溶解し、これを100 µL ずつ添加した後、37℃で2時間培養した。その後、色素導入溶液を100 µL 1mM プロベネシド含有HHBS で置換した。TRITCチャネルを用いた蛍光顕微鏡 (Olympus IX71) を使って、50 µL の 300 µM ATP 添加前後の画像を撮影した。

図.6 0 - 39µM 遊離Ca²⁺存在下における Cal-630™ の蛍光スペクトル

図.7 プロベネシドを添加した Cal-630™ AMによる、ATP刺激性した CHO-K1細胞の細胞内カルシウム応答 (蛍光プレートリーダー解析)
CHO-K1細胞を96ウェル黒壁/透明底コースタープレートに播種 (50,000 cells/100 µL) し、一晩培養した。2.0 mM プロベネシド添加した100 µL の10 µg/mL Cal-630™ AM を細胞に添加し、37℃で 2時間培養した。ATP (50 µL/well) を FlexStation® (Molecular Devices ) を使って添加した。

図.8 プロベネシドを添加した Cal-590™ AM による、ATP刺激した CHO-K1細胞内在性P2Y受容体の細胞内カルシウム応答
CHO-K1細胞を96 well 黒壁/透明底コースタープレートに播種 (40,000 cells/100 µL) し、一晩培養した。1mM プロベネシドを添加した HHBS に 4 µM Calbryte™ 590 AM (品番20701) を溶解し、これを 100 µLずつ添加した後、37℃で2時間培養した。その後、色素導入溶液を 100 µL の 1 mM プロベネシド含有HHBS で置換した。TRITCチャネルを用いた蛍光顕微鏡 (Olympus IX71) を使って、50 µL の 300 µM ATP 添加前後の画像を撮影した。

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