従来の検出色素より広範囲・高感度に検出 PROTEOSTAT® タンパク質凝集測定アッセイ

PROTEOSTAT® タンパク質凝集アッセイは、タンパク質製剤製造におけるペプチドやタンパク質の凝集を測定する、簡単で均質な分析評価フォーマットをご提供致します。このアッセイを活用することで、タンパク質の加工を合理化し、製剤方法の最適化を可能にします。

PROTEOSTAT® 検出試薬は、チオフラビンTといった通常のタンパク質凝集検出色素と比べ、より広範囲の異なるタンパク質凝集体を検出します。このアッセイは、チオフラビンTよりも、はるかに明るいシグナルを示し、2桁以上高い直線的なダイナミックレンジで、広範囲のpH（4〜10）において優れた性能を示します。感度はμM以下で、1〜5％の濃度なら溶液のままで検出可能です。評価は、簡便なミックスを使って導き出される−0.5以上の因子スコアのZ’ファクターで求められます。そのため、強くハイスループットなタンパク質凝集の定量分析が可能です。また、凍結乾燥した天然型タンパク質の凝集体をネガティブコントロールとポジティブコントロールとして一緒にご提供しています。

• 簡単：サンプルの分離や希釈を行わずにタンパク質凝集を検出
• 集約的測定技術のクロスバリデーションに対する便利かつ相補的な直交方法を提供
• 一般的なバッファー（PBS等）や賦形剤（トレハロース、ショ糖）に適合
• ハイスループット評価に対応し、様々なタンパク質製剤に最適化
• 生産過程でのタンパク質ダメージに関わる問題解決に有用
• 非特異的なアッセイ産物を排除し、厳密な製造を可能に

• PROTEOSTAT® 検出試薬
• PROTEOSTAT® ポジティブコントロール（Aggregate）
• PROTEOSTAT® ネガティブコントロール（Monomer）
• PROTEOSTAT® アッセイバッファー（10X）

タンパク質はpH の値、温度、バッファー、光、酸素、攪拌、凍結融解サイクルなどのストレスによりミスフォールドがおこり凝集します。PROTEOSTAT® タンパク質凝集検出試薬はタンパク質サンプル中の凝集を定量化できます。PROTEOSTAT® タンパク質凝集検出試薬は分子ローター色素で、タンパク質凝集がない場合プロペラのように回転して蛍光を発しません。色素が凝集に結合して固定され、回転運動が遅くなると、蛍光を発します。タンパク質の疎水性部位を露出してアンフォールディングを測定する他の環境感受性色素とは異なり、疎水性化合物や界面活性剤の干渉がわずかです。

PROTEOSTAT® 検出試薬とチオフラビンTの比較
精製抗ヤギIgG（ウサギ）（4.26b/e）を凝集させるために、pH2.7,80℃のHCl溶液でインキュベートした。凝集体からのシグナルは、凝集体を混ぜてから決定され、異なる比で凝集体と単量体とを混ぜたが、総IgG濃度は60b/fとした。50mMリン酸カリウムバッファー、pH7に3μM PROTEOSTAT® 検出試薬または5μMチオフラビンTを混合して値を計測した。蛍光の値は、PROTEOSTAT®検出試薬では、励起光500nm、蛍光 603nm、チオフラビンTでは、励起光435nm、蛍光 495nmに設定し、BioTek Synergy Mxマイクロプレートリーダーを用いて検出した。3点測定は、Greiner hClear® black, clear bottom 96ウェルマイクロプレートに沈着させて行った。PROTEOSTAT® 検出試薬のシグナルは、チオフラビンTと比べ100倍以上明るかった。また、チオフラビンTと比べて集中カーブも優れていた。

ProteoStat® 試薬を使った凝集傾向の予測と抗体薬物複合体 (ADC) の凝集のモニタリング

ENZ社では Innate Pharma社と協力し、抗体薬物複合体 (ADC) 創薬研究における PROTEOSTAT® Aggregation Assay と PROTEOSTAT® Themal Shift Assay の利用についてバリデートしました。調査中、モノクローナル抗体と結合した無数の細胞分裂阻害作用・抗腫瘍試薬が観察されました。この調査ではInnate Pharma社のカップリング技術が安定性や堅牢性に優れたADC産物の開発に非常に優秀なプラットフォームであることも確かめています。さらに、ENZ社のPROTEOSTAT®染色試薬を利用した結果、有望な候補薬物の最適化やスケールアップ、ADCsの開発に役立つユニークなツールであることも確認できました。

ImageStreamX®イメージングフローサイトメトリーおよびPROTEOSTAT®Protein Aggregation Assayを用いた治療用タンパク質製剤の粒子分析

タンパク質ベースの薬物内でのタンパク質凝集体（PA）および他の目に見えない粒子の形成は、薬物活性に影響を与え得るかまたは患者における望ましくない免疫原性を引き起こす可能性があるため、製薬産業にとって大きな懸念事項です。これらの薬剤の安全性と有効性を確保するためには、特にその形成が生産および貯蔵条件に対して非常に敏感であり得るため、これらの微粒子の存在を監視することが重要です。現在、米国および欧州の医薬品規制では、目に見えない（> 10μm）および目に見える（> 25μm）粒子の治療薬が必要であり、最近の文献では、1〜10μmのサイズ範囲で粒子を測定する重要性が強調されています。別の新たな要求は、シリコーン油滴および細菌がこのサイズ範囲内に存在する可能性があるので、粒子タイプを分類する必要があることです。現在受け入れられている業界の方法では、1〜100μmの臨界サイズ範囲内で粒子を同時にサイズ、列挙、および分類する必要性を満たさないため、このアプリケーションの新しいアプローチを開発する必要性が示されています。この研究では、Aminis ImageStreamX MKII（ISX）イメージングフローサイトメーターがこれらの基準に対応し、治療用タンパク質製剤の包括的な微粒子特性を可能にする可能性を評価します。 ISXの主な利点は、フローサイトメトリーと顕微鏡のカップリングであり、粒子タイプを特定の蛍光染色と、高解像度画像からのサイズなどの形態学的特性の定量的測定を用いて分類することができることです。伝統的なフローサイトメトリーは以前このアプリケーションに適用されていましたが、イメージングフローサイトメトリーに比べて制限されています。これは、粒子のサイズを直接的に決めることができず、小さな粒子や半透明の粒子の検出には敏感でなく、形やコントラストのようなものです。

フローサイトメトリーによるタンパク質凝集体の迅速な検出とキャラクタリゼーション

治療用タンパク質製剤は、しばしば、タンパク質凝集の問題によって悩まされます。タンパク質凝集体を生じる汚染物質は、宿主細胞タンパク質、非タンパク質物質、またはタンパク質製品自体の損傷形態を含み得ます。残念ながら、これらの粒子のモニタリングおよび同定は困難であり、サイズ排除クロマトグラフィーおよび天然ゲル電気泳動に限定されています。この研究では、フローサイトメトリーおよびタンパク質凝集体（PROTEOSTAT®）または油滴（Bodipy）に特異的な色素を組み合わせて使用??して、治療用製剤中の粒子を同定し、これらの粒子のサイズを評価します。結果は、低pHでの加熱後にIgGから形成されたタンパク質凝集体が2ミクロン未満の平均サイズを有することを示します。IgG由来の凝集物は、タンパク質と混合されたシリコン油微小液滴から明確な集団を形成します。この研究は、治療用タンパク質サンプルの分析のためのPROTEOSTAT®色素と組み合わせたフローサイトメトリーの使用の有用性を示しています。単一の単純なプロトコルを使用して、粒子の相対サイズおよび数、ならびに粒子（凝集タンパク質、油滴または他の固体材料）の性質を検出することができます。

• 詳細はPROTEOSTAT® 熱安定性アッセイキットをご参照ください。

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