熱ストレス条件下でタンパク質凝集を測定 ProteoStat® 熱安定性アッセイキット

ProteoStat® 熱安定性アッセイキットは、タンパク質の凝集を迅速かつ簡単な方法で検出するキットです。

熱によってシフトする色素は、凝集したタンパク質の非存在下で、非常に低い蛍光を示しますが、凝集したタンパク質に結合すると、明るい蛍光を示します。

• シンプルで高感度な蛍光アッセイ
• 加速された様式でタンパク質安定性条件を最適化することが可能
• 簡便なリガンド結合検出
• 幅広い緩衝液および賦形剤と適合

• ProteoStat^® TS Detection Reagent (1000X), 25 µl
• β-Lactoglobulin control, 16 mg
• 10X Assay Buffer, 1.2 ml

図.1 ヤギ抗マウスIgG（pH 7.4で11.2mg / ml）について、PROTEOSTAT®熱安定性アッセイの典型的な結果
3°/分の速度で30℃から99℃まで温度を上昇させるようにプログラムされたRT-PCR装置を使用し、蛍光を連続的に読み取った。青色の線は生の蛍光データを表し、赤色の線は対応する一次導関数トレースを示し、蛍光強度曲線の傾きを示している。一次微分プロットは、タンパク質の凝集温度を示している（Tagg：最大勾配の点）。

図.2 PROTEOSTAT®Dyeの凝集温度とSYPRO®Orangeを使用して得られた融解温度との不等価
SYPRO Orange色素は折り畳まれていないタンパク質の疎水性領域に結合する環境感受性色素で、熱変性曲線の中間点であるTm値の測定に使用されている。Tm値では、サンプル中の標的タンパク質の半分が折り畳まれず、半分が折り畳まれたままの状態を示す。折り畳まれていない状態のタンパク質は隣接するタンパク質には依存しない。 ProteoStat はタンパク質凝集体の表面に結合する分子ローター色素で、Tagg は熱凝集曲線の中間点を示す。凝集は、タンパク質の立体構造がほどけた後起こる。凝集は隣接するタンパク質に依存し、タンパク質濃度が高ければ凝集する蛍光が高くなる。

ProteoStat®試薬を用いた抗体 - 薬物コンジュゲート（ADC）の凝集傾向の予測と凝集のモニタリング

Innate Pharma では抗体薬物複合体 (ADC) カップリングテクノロジーを開発してきた。MMAE毒素と非グリコシル化SGN30Q/S変異体との結合を、1ステップ (SGN30 Q/Slinker-vcMMAE) もしくは2ステップ (SGN30 Q/S-Linker-Click-Linker-vcMMAE) のどちらかで行い、それらの安定性や臨床応用への技術コンセプトの検証のため、ADCETRIS® (初めてFDA認可されたADC) と比較した。凝集温度は ProteoStat® Thermal Shift アッセイで決定し、下記に示すような凝集傾向予測を確立した。

• 4量体MMAEトキシンと結合したSGN30 Q ADCは、2量体MMAEトキシンと結合したSGN30 SADCよりも不安定であった。
• 脂溶性リンカーと結合したADCは、親水性リンカーよりも不安定であった。
• ADCETRIS® は脂溶性リンカーで結合したSGN30 Q ADC よりも安定であったが、親水性リンカーで結合したSGN 30 Q ADCよりは不安定であった。

加速分解研究では、このヒエラルキー (ADCETRIS®は、その抗体因子の高い断片化のため除く) を確認し、ProteoStat® Thermal Shift アッセイはADC産物の凝集傾向を予測できるということを確認している。

詳細はProteoStat® タンパク質凝集アッセイをご参照ください。

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