従来法の単一波長蛍光カルシウム指示薬 蛍光単一波長カルシウム指示薬

カルシウムは様々な細胞での万能なセカンドメッセンジャーです。無数の機能が Ca²⁺ により制御されているため、カルシウム指示薬を用いたカルシウム測定は重要な生化学調査の1つになっています。1920年代から Ca²⁺ の測定が試みられ多様な指示薬が開発されてきました。

蛍光指示薬を用いることで、細胞内の遊離Ca²⁺濃度の変化を各種機器 (蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光分光法及び蛍光マイクロプレートリーダー) から確認することができます。これら蛍光指示薬のほとんどが、カルシウムに応答するPET機構 (光誘起電子移動) を組み込んだBAPTAキレーターの誘導体です。蛍光指示薬を選択する際は、ご自身の実験に適したスペクトル特性、測定モード、透過性 (AMフォーム：生細胞中のアッセイに適した細胞透過性タイプ、塩フォーム：生細胞や組織へのマイクロインジェクションに適したタイプ)、 解離定数 (Kd) を選択ください。

• スペクトル特性：UV励起には、Indo-1とFura-2が広範に使用されています。Fura-8™は新しく開発された励起を比率化できるカルシウム色素です。そのAM体はFura-2 AMより優れており、細胞内での高いシグナル/バックグラウンド比率を示します。Fluo-8®, Cal-520®、Calbryte™ 520 は、488nm励起が好まれることに対し、Cal-590™、Calbryte™ 590、Cal-630™、Calbryte™ 630、Rhod-2、および Rhod-4™は赤色蛍光に使われます。
• 測定モード：イオン結合によりスペクトルシフトを示すイオン指示薬は、Ca²⁺濃度の比率計測に使用でき、不均一な色素のローディング、細胞の厚さ、光退色効果、及び色素漏出には基本的に依存しません。励起と蛍光波長の嗜好性は、使用機器のタイプやサンプルの自己蛍光、および実験系に他の蛍光や光で活性化されるプローブが存在するかどうかに依ります。 Indo-1、Fura-2 、およびAAT Bioquest社の開発したFura-8™は主に比率計測用に使われ、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8®、Cal-520®、Calbryte™ 520、Cal-590™、Calbryte™ 590、Cal-630™、Calbryte™ 630、Rhod-2、およびRhod-4™は主に単一波長測定で使われます。
• Ca²⁺指示薬の透過性 (塩またはAMエステル)：塩形態のものは通常、微量注入、微粒子銃、またはエレクトロポレーションで細胞に導入されるか、細胞外アッセイに使用されます。これに対し、細胞透過性アセトキシメチル (AM) エステルは細胞内に受動的に導入することができ、そこで細胞内エステラーゼにより細胞不透過性産物へと切断されます。
• 解離定数 (Kd)： 希望する指示薬は対象とする Ca²⁺濃度領域に対して適切な Kd値をもつ必要があります。Ca²⁺指示薬のKd値は、pH、温度、イオン強度、年度、タンパク質結合、Mg2+ や他のイオンの存在といた数々の因子に依存します。その結果、細胞内指示薬の Kd値は対応する無細胞溶液中で測定した値に比べ通常著しく高くなります。可視光励起カルシウム指示薬のうち、Fluo-8®、Fluo-4、Fluo-3、Rhod-2、および Rhod-4™ が最も一般的に使用されています。Fluo-8® 指示薬はフローサイトメトリーと共焦点レーザー走査顕微鏡において幅広く使用されています。近年では Fluo-8® AM が GPCR標的のハイスループットスクリーニングにおいてよく使用されています。Fluo-8® は Ca²⁺ に結合し飽和Ca²⁺の存在下で〜0.15の量子収量を示しCa²⁺に対してKd が 390 nM を示さない限り、基本的に非蛍光です。Cal-520® はシグナル/バックグラウンド比率と細胞内保持力が非常に改善された頑強な緑色蛍光カルシウム指示薬です。Calbryte™ 520 は、シグナル/バックグラウンド比率と細胞内保持力が著しく改善され、さらに簡単な細胞色素導入特性をもつ、突出して優れた 488 nm で励起する緑色蛍光カルシウム指示薬です。

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