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Q&A

記事ID : 14019

FAQ : サンタクルズ(SCB)社 CRISPR/Cas9 ゲノム編集用ツールについて

【01】 RNA干渉(RNAi)と比べてCRISPR/Cas9システムの利点はなんですか。

RNA干渉ではmRNAを標的し崩壊させるのに対し、CRISPR/Cas9システムはゲノムDNAを標的し編集することで対象タンパク質をノックアウトします。ゲノムDNAが編集されると、この変化は永久に持続します。

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【02】 ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)やTALENよりCRISPR/Cas9ゲノム編集ツールが好まれるのはなぜですか。

CRISPR/Cas9システムはこれらより安価かつ切断効率と特異性がより優れています。

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【03】 ガイドRNA(gRNA)配列のデザイン方法を教えてください。

サンタクルズ(SCB)社では、GeCKO v2ライブラリーより公表されている3種のgRNA標的配列プールを利用しま す。公表されているこれらの配列は編集効率が高く、オフターゲット作用が低いことが示されています。

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【04】 gRNA配列は提供されますか。

はい、gRNA配列はご購入後、お客様に開示致します。お問合せください。

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【05】 なぜCRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドは3種の標的RNA配列をプールして提供されるのですか。

SCB社では十分な遺伝子破壊を確実に行うため、3種のgRNA配列をプールしてCRISPR/Cas9 ノックアウトプラス ミドとしてご提供しています。

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【06】 CRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドを3種のgRNAプールではなく単独で提供してもらえますか。

はい。CRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドセットをご購入頂き、その後、カスタムオーダーとして単一gRNAの CRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドをご購入いただくことが可能です。お問合せください。

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【07】 HDR プラスミドは3種のプールとして提供されますか。

はい。各HDR プラスミドはそれぞれ相当するgRNAに対して機能するようデザインしており、2〜3種のプールとして提供されます(遺伝子により異なります)。

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【08】 CRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドのみを遺伝子機能のノックアウトに単独で使用できますか。

はい。ただし、非相同末端結合(NHEJ)が起こり、挿入欠失が生ずる可能性があります。挿入欠失により読み取 り枠(ORF)が変わり、二本鎖切断(DSB)以降のアミノ酸配列が大きく変わったり、中途での停止コドンが生じたり する可能性があります。NHEJにより生じた挿入欠損はランダム変異となる可能性もあり、遺伝子破壊の種類や範 囲を実験的に決定する必要があります。

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【09】 自分の細胞にCRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドがトランスフェクションできたかどうか調べる方法を教えて ください。

GFP発現を確認してトランスフェクション効率を決定することができます。また、遺伝子ノックダウンの程度を確 認するため、さらなるアッセイも必要となります。

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【10】 自分の細胞にHDR プラスミドがトランスフェクションできたかどうか調べる方法を教えてください。

RFP発現を確認してトランスフェクション効率を決定することができます。また、遺伝子ノックダウンの程度を確認するため、さらなるアッセイも必要となります。

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【11】 CRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドとHDR プラスミドを用いてゲノム編集が問題なく生じたことを調べる方 法を教えてください。

編集が行われた細胞にはそのゲノムDNAにピューロマイシン耐性遺伝子が組み込まれているため、ピューロマイ シン選択を行うことができます。

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【12】 HDR プラスミドの相同性左腕(LHA)と相同性右腕(RHA)の長さはどれくらいですか。

ゲノムDNAとの適切なアライメントと相同性配向型修復を確実なものとするため、800塩基あります。

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【13】 CRISPRコントロールはありますか。

SCB社ではCRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドに1つのスクランブルgRNA配列を組み込んだネガティブコン トロール(品番:SC-418922)をご用意しています。スクランブルgRNA配列はゲノム標的DNAに結合せず、また、Cas9/gRNA複合体は結合せず、DSBを生じません。

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【14】 PAM配列とは何ですか。

プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列はDNA標的配列の3'末端に存在している必要があり、gRNA配列には 存在しません。Cas9がDNAにうまく結合するためには、ゲノムDNA内の標的配列はgRNA配列に対して完全に相 補であり、3'末端に連続してPAM配列をもつ必要があります。

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【15】 Cas9/gRNA複合体はゲノムDNAのどの位置を切断するのですか。

Cas9はゲノムDNA内の標的配列3'末端の下流約3〜5塩基対を切断します。

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【16】 CRISPR/Cas9システムは分裂細胞と非分裂細胞の双方に使えますか。

はい、両方に使えます。分裂細胞ではNHEJまたはHDR経路が利用され、非分裂細胞ではNHEJ経路のみが利用さ れると考えられます。

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【17】 異なる細胞株によって効果にばらつきがみられますか?

はい。効果は細胞株や標的配列によって変動します。

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【18】 CRISPR/Cas9システムでは、標的遺伝子のノックダウンをどのように確認しますか。

遺伝子ノックダウンを確認する方法はいくつかあります。ピューロマイシンによりHDRプラスミドにより編集さ れた細胞を選択することができます。ウェスタンブロット分析によりタンパク質ノックダウンの確認が可能です。 また、ゲノムPCRによりゲノム組込みを確認できるでしょう。ゲノム配列を増幅後、PCR断片をクローニングして配列決定することで変異の検出もできるかもしれません。

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【19】 トランスフェクションの検証を行う場合、ウェスタンブロットや免疫蛍光法はどのように利用できますか。

ウェスタンブロットや免疫蛍光法ではCas9タンパク質の発現が確認できます。RFPマーカーを利用して顕微鏡下 で蛍光の可視化もできますし、Cas9抗体を利用することもできます。

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【20】 一度にいくつの遺伝子をノックアウトできますか。

一度にノックアウトできる最大遺伝子数はまだよくわかっていません。種々の研究より一度に複数の遺伝子をノックアウトできることが示唆されていますが、これは細胞への同時導入がどれだけできるかによります。SCB社のCRISPR/Cas9ノックアウトプラスミドに関しては1標的遺伝子ずつご利用いただくことを推奨し、保証しています。

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【21】 CRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミドを利用する場合、SCB社のどのトランスフェクション試薬や関連商品を購 入する必要がありますか。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格

Control CRISPR/Cas9 Plasmid,詳細データ

SCB SC-418922 20 UG
¥16,000

shRNA Plasmid Transfection Reagent,詳細データ

SCB SC-108061 0.2 ML
¥14,000

shRNA Plasmid Transfection Medium,詳細データ

SCB SC-108062 20 ML
¥1,000

Puromycin dihydrochloride,詳細データ

SCB SC-108071 25 MG
¥6,000

SCB社では、各標的特異的CRISPR/Cas9 ノックアウトプラスミド用のコントロール抗体もご提供しています。

【22】 HDRプラスミドはダブルニッカーゼプラスミドと組み合わせて使用できますか。

いいえ。HDRプラスミドはKOプラスミド(野生型Cas9)用にデザインされており、 ダブルニッカーゼプラスミド(ニッカーゼ改変型Cas9)と組み合わせた使用はできません。

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【23】 CRISPR / dCas9 Lentiviral Activation Particle(ウイルス粒子)をトランスダクションした場合、ゲノムにインテグレートされて、安定的に標的遺伝子のプロモーターを活性化することができますか?

理論的にはレンチウイルス粒子を感染させた場合、ゲノムに組み込まれ安定的にプラスミドを発現します。しかしながら、遺伝子の活性化が安定して生ずるためには、CRISPR-dCas9レンチウイルスActivationシステムを構成する3種のプラスミドすべてがゲノムに組み込まれ、発現する必要があり、そのような状況になるかどうかは定かではありません。

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