フローサイトメトリー用　細胞内染色方法

フローサイトメトリーのための細胞の固定および透過処理には多くの方法があり、細胞の種類、ターゲット、アプリケーションによってプロトコルを最適化する必要があります。ここでは、フローサイトメトリー用の抗体を用いて、懸濁液中の細胞をフローサイトメトリー用に固定/透過させるための基本的なプロトコルをご紹介します。
細胞外の細胞表面抗原の染色については、こちらをご参照ください。

• 商品情報：Live-or-Dye™ Fixable Viability 染色キット

• 1×PBS
• Live-or-Dye™ Fixable Viability Stain(品番#32018など) (オプション)
• Flow Cytometry Fixation/Permeabilization Kit
• 一次抗体
• 二次抗体(蛍光標識された一次抗体をご使用の場合には必要ございません。)
• Flow buffer (PBS + 2% bovine serum or BSA + 0.02% sodium azide)
• フローサイトメトリーチューブ(12 x 75 mm polypropylene tubes)

1. トリプシン処理または市販の非酵素的セルリフト溶液を使用して、付着細胞を剥離する。
2. 【オプション】死細胞を分析から除外するには、PBSで細胞を再懸濁し、製品のプロトコルに従って、Live-or-Dye™ Fixable Viability Stainsなどの固定可能な死細胞用色素で染色する。
3. 【オプション】細胞表面マーカーの抗体染色を行う。（「細胞表面染色方法」参照）
4. Flow bufferで細胞密度を1×10⁷個/mLに調整する。
5. 100 µLの細胞懸濁液をフローサイトメトリーチューブに分注し、チューブあたり1×10⁶個の細胞を回収する。
6. 各チューブに100µLの固定用バッファーを加え、穏やかにボルテックスして混合する。その後、室温で20分間インキュベートする。
   注）直接標識した一次抗体を使用する場合は、チューブを遮光する。
7. 各チューブに1mLのPBSを加え、350×gで5分間遠心分離して細胞をペレット化する。
8. 洗浄液を廃液容器に流す。
9. 各チューブに100µLの透過性バッファーを加え、穏やかにボルテックスして混合する。
10. チューブに一次抗体を加え、軽くボルテックスして混ぜる。室温で30分間インキュベートする。
    注：一次抗体の濃度は用途に応じて最適化する必要がありますが、チューブあたり0.5〜1µgの抗体が一般的な開始濃度です。
    注：直接結合した蛍光一次抗体を使用する場合は、サンプルを光から保護してください。
11. 各チューブに1mLのフローバッファーを加えて洗浄する。350×gで5分間の遠心分離を行い、細胞をペレット化する。
12. 洗浄液を廃液容器に流す。その後、手順11を繰り返す。
13. 直接標識された一次抗体を使用する場合は、手順17に進む。二次抗体を使用する場合は、手順14に進む。
14. 洗浄バッファーを流した後、残りのバッファー（〜100 µL）に細胞を優しくボルテックスして再懸濁する。 各チューブに1µgの二次抗体を加え、軽くボルテックスして混合する。遮光して室温で30分インキュベートする。
    注：ビオチン化一次抗体の検出には、ストレプトアビジンコンジュゲートを使用することができ、通常0.25µg/tubeで使用します。
15. Flow bufferで細胞を2回洗浄する（ステップ8~9を繰り返す）。
16. 洗浄バッファーを流した後、チューブごとに500µLのFlow bufferを加える。
17. フローサイトメトリーでは、コンジュゲートに適したチャンネルで分析する。各サンプルをサイトメーターにロードする前に、穏やかにボルテックスして混合する。
    注：細胞は、分析前に遮光して4℃で数日間保存することができます。